响应面法优化超声辅助提取皱盖假芝脂溶性成分的研究*

黄纪国，韩园园，谢意珍，潘鸿辉**

（1.广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070；2.广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663）

响应面法优化超声辅助提取皱盖假芝脂溶性成分的研究*

黄纪国1，2，韩园园1，谢意珍1，2，潘鸿辉1，2**

（1.广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070；2.广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663）

为了优化超声辅助提取皱盖假芝脂溶性成分的工艺。在单因素的实验基础上，采用响应面法进行实验设计，选取料液比、提取时间、提取温度、提取功率进行四因素三水平实验，最终得到超声辅助提取皱盖假芝脂溶性成分的最佳工艺条件为：料液比36.74 mL·g－1，提取时间47.31 min，提取温度90℃，提取功率82 W。在此条件下，提取率为8.4891%。因此超声辅助提取工艺简单且稳定，是可行的提取方案。

皱盖假芝；脂溶性成分；超声辅助提取；

灵芝为多孔菌科真菌赤芝 [Ganoderma luicdum（Leyss.ex Fr.）Karst.]或紫芝（G.sinense Zhao，Xu et Zhang）干燥子实体[1]，具有滋补强壮、延年益寿、补气安神等功效。目前，从灵芝中分离得到150多个化合物，如三萜类、甾醇类、挥发油、生物碱、甘露醇、呋喃衍生物等[2]。由于灵芝本身可以食用，对人体具有低毒性，并且活性成分具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、消炎抗菌以及保肝护肝等功效，毒副作用小，因此成为各种抗肿瘤、抗病毒等药物的重要来源[3－9]。

皱盖假芝隶属于灵芝科假芝属，在我国主要分布于华南和西南地区，其子实体因受损会分泌红色的液体，又名血芝[10]。前期研究发现，相比其他食用菌，皱盖假芝在抗肿瘤活性方面明显优于其他食用菌（包括灵芝），其中抑制肿瘤细胞繁殖及诱导凋亡的主要活性成分来自小分子化合物（脂溶性成分）[11]。因此提高皱盖假芝脂溶性成分提取率，为后期开发皱盖假芝提供科学依据具有重要的意义。

响应面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法，广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等方面。它与正交试验设计法不同，具有试验周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点，而且超声波辅助技术具有快速、高效、安全、产率高、节能、生物活性保持率高等特点[12-14]。本试验拟在单因素试验基础上，利用响应面法对超声辅助提取皱盖假芝脂溶性成分进行工艺优化。

1 材料与仪器

AS10200BDT超声波清洗器，添加奥特赛恩斯仪器有限公司；95%乙醇（食品级），广东环凯微生物科技技术有限公司；科恩电子天平（ALT 160-4NM），德国科恩公司；旋转蒸发仪（EYEL4 SB-1100），日本东京理化器械（株）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-P053A），上海百典仪器设备有限公司；旋转蒸发仪 RE-3000，上海亚荣生化仪器厂；DLSB-5/20型低温冷却液循环泵，郑州长城科工贸有限公司；SHB-S循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

皱盖假芝购自安徽大别山种植户，并经广东省微生物研究所食用菌研究发展中心鉴定。

2 提取流程

称量一定量的干燥、粉碎后皱盖假芝子实体，加入一定量的75%食用酒精，一定的提取温度、时间和提取功率进行成分提取，收集皱盖假芝提取液并且过滤浓缩，干燥，即得到皱盖假芝脂溶性成分。计算皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率（Y）公式如下：

式中：m为皱盖假芝脂溶性成分的重量（g）；M为皱盖假芝子实体的干重（g）。

3 实验

3.1单因素试验

在其他条件相同的情况下，分别考察提取温度（50℃、60℃、80℃、95℃），提取时间（30 min、45 min、60 min、75 min），提取功率（50 W、70 W、90 W、100 W），料液比（15 mL·g-1、25 mL·g-1、35 mL·g-1、45 mL·g-1）四因素对皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率的影响。

3.2响应曲面法试验设计

在单因素实验的基础上，选取四因素三个水平进行响应面实验，并进行皱盖假芝子实体脂溶性成分提取工艺的研究。采用Design-Expert.8.05b（原版）软件设计的Box-Benhnken设计方案，试验因素水平编码见表1。

表1 响应面分析影响因素及水平Tab.1 RSA experiment factors and levels

以皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率为响应值（Y），设计了四因素三水平的响应分析实验，总计29个试验。

4 结果与讨论

4.1单因素对皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率的影响

4.1.1 料液比对皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率的影响

料液比对脂溶性成分提取率的影响见图1。

由图1可见，相同条件下的皱盖假芝子实体（60 min、85 W、75℃），料液比越高，皱盖假芝子实体与溶剂的接触面浓度差越大，渗透压越大，脂溶性成分越容易浸出；当达到一定程度后，由于脂溶性成分含量减少，提取率逐渐趋于稳定。当料液比35 mL·g-1时，其脂溶性成分提取率达到6.47%。

4.1.2 提取时间对皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率的影响

提取时间对皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率的影响见图2。

图1 料液比对提取率的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the extraction yield

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 Effects of extraction time on the extraction yield

由图2可见，相同条件下的皱盖假芝子实体（35∶1、75℃、85 W），提取时间越长，超声波对子实体的作用就越充分，脂溶性成分提取越充分；当到达一定的时间后，达到平衡，提取率趋于稳定。提取时间为60 min，其脂溶性成分提取率达到6.65%。

4.1.3 提取温度对皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率的影响

提取温度对皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率的影响见图3。

图3 提取温度对提取率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on the extraction yield

由图3可见，相同条件下的皱盖假芝子实体（35∶1、60 min、85 W），当提取温度提高时，有利于脂溶性成分的浸出；由于酒精沸点为79℃，当温度高于80℃以后，酒精蒸发出来，溶剂的极性增加，但整个料液比有所降低，因此提取率增加速度变缓。当提取温度为80℃，皱盖假芝的提取率达到7.076%。

4.1.4 提取功率对皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率的影响

提取功率对皱盖假芝子实体脂溶性成分提取率的影响见图4。

图4 提取功率对提取率的影响Fig.4 Effects of extraction power on extraction power

由图4可见，相同条件下的皱盖假芝子实体（35∶1、60 min、75℃），超声功率越大，空化和机械作用效果越明显，脂溶性成分渗出的越多；当提取功率超过90 W时，反而不利于脂溶性成分的渗出。

4.2响应面实验结果与分析

4.2.1 响应面试验方案及结果

以X1、X2、X3、X4为自变量，皱盖假芝脂溶性成分的提取率为响应值Y，利用Design-Expert.8.05b软件，采用Box-Benhnken设计方案及结果见表2。

4.2.2 响应面试验结果方差分析

利用Design-Expert.8.05b软件对响应值进行回归分析，经回归拟合后，各因子与响应值的回归方程为：Y=－29.73720＋0.27915×X1＋0.43016×X2＋0.29496×X3＋0.15853×X4－0.000938667×X1×X2－0.00209333×X1×X3＋0.0000746667×X1×X4－2.45333E－003×X2×X3－0.000459556×X2×X4－0.00066×X3×X4－0.000714347×X12-0.00144919×X22＋0.000122815×X32－0.000488074×X42。模型方差分析见表3。

模型中，如果模型项p≤0.05，说明Y与因子之间的回归方程的关系是显著的，如果p≤0.01，说明Y与因子之间的回归方程的关系是极其显著的；如果p≤0.05的项，表示该项对Y影响显著，p≤0.01的项，表示该项对Y影响极其显著，由方差分析结果可知，该回归方程模型极其显著，其中X1、X3、X2X3三项对脂溶性成分的提取率影响极其显著；X4、X1X3、X22三项对脂溶性成分的提取率影响显著，其他影响因子对响应值的影响不是简单的线性关系。

表2 Box－Behnken设计方案及试验结果Tab.2 Box－behnken design of extraction technology and results

表3 方差分析表Tab.3 Results of extraction regression analysis

4.2.3响应曲面及等值线分析

利用Design－Expert.8.05b软件对表2的数据进行回归方程拟合，建立响应面及等高线，结果见图5～图10。

图5反映的是料液比与提取时间对提取率的影响。从图5可以看出，当料液比不变时，随着提取时间的延长，其提取率先是逐渐增加，达到一定值之后又逐渐下降；当提取时间一定时，料液比越高，提取越充分。

图6反映的是料液比与提取温度对提取率的影响。从图6可以看出，当料液比一定，提取温度越高，其提取率越高；当温度恒定时，料液比越大，脂溶性成分提取率也提高。

图7反映的是料液比与提取功率对提取率的影响。从图7可以看出，当料液比相同时，提取功率越高，提取率也越高；功率相同时，料液比越高，提取率也越高。

图8反映的是提取时间、提取温度与提取率三者之间的作用关系。由图8可见，当提取温度相同时，提取时间越长，越有利于脂溶性成分的浸出；提取时间相同时，随着提取温度的升高，提取率逐渐增加。

图9反映的是提取时间与提取功率之间如何作用于提取率的。相同的时间内，提取功率越高，其提取率也越高；当功率相同时，时间不同，提取率也不同，提取率是先逐渐增加，到达最大值后又慢慢的减小。

图10反映的是提取温度与提取功率对提取率的影响。当提取温度相同，提取功率越高，其相应的提取率也越高；当功率相同时，提取率随着提取温度的提高而增加。

图5 料液比与提取时间对提取率影响的等高线和响应面Fig.5 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors solid-liquid ratio(X1)and extraction time (X2)

图6 料液比与提取温度对提取率影响的等高线和响应面Fig.6 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors solid-liquid ratio(X1)and extraction temperature(X3)

图7 料液比与提取功率对提取率影响的等高线和响应面Fig.7 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors solid-liquid ratio(X1)and extraction power(X4)

图8 提取时间与提取温度对提取率影响的等高线和响应面Fig.8 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors extraction time(X2)and extraction temperature(X3)

图10 提取温度与提取功率对提取率影响的等高线和响应面Fig.10 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors extraction temperature(X3)and extraction power(X4)

5 结论

通过Design-Expert.8.05b软件分析，推算出皱盖假芝脂溶性成分的提取最佳工艺为：料液比36.74 mL·g-1，提取时间47.31 min，提取温度90℃，提取功率82 W，在此条件下皱盖假芝脂溶性成分的提取率为8.49%。通过与实际情况相比较，相同工艺条件下，实际测得提取率为8.4891%，与理论预测值的相对误差较小。因此最终确定超声辅助提取皱盖假芝脂溶性成分的最佳工艺条件与推算的最佳工艺条件相同。

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Optimization of Ultrasound-assisted Extraction Process for Fat-soluble Components from Amauroderma rude by Response Surface Analysis

HUANG Ji-guo1,2,HAN Yuan-yuan1,XIE Yi-zhen1,2,PAN Hong-hui1,2
(1.Guangdong Institute of Microbiology,State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China,Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application,Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou 510070,China;2.Guangdong Yuewei Edible Fungi Technology Co.Ltd,Guangzhou 510663,China)

For optimizing the ultrasound－assisted extraction technology of fat－soluble components from Amauroderma rude,the impact of solid－liquid ratio,extraction time,extraction temperature and extraction power on the yield of fat－soluble components from Amauroderma rude were investigated.Through Box－Benhnken central combination design and response surface methodology,it was indication that the optimum extraction condition as follows:solid－liquid ratio 36.74 mL·g－1,extraction time 47.31 min, extraction temperature 90℃and extraction power 82 W.Under such conditions,extraction yield was up to 8.4891%and it was a feasible extraction program.

Amauroderma rude;fat－soluble components;the ultrasound－assisted extraction

S646.9

A

1003-8310（2015）03-0041-06

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.011

广东省产学研省部合作专项基金项目（2012B090600050）；广东省工程技术研究开发中心建设项目（2010B080100068）。

黄纪国 （1986－），男，硕士，研究助理，主要从事食（药）用真菌研究及开发方面工作。E－mail:huangjiguo@126.com

**通信作者：潘鸿辉 (1979－），女，博士，副研究员，主要从事食（药）用真菌研究及开发方面工作。E－mail:phhcys@yahoo.com

2015－03－10