基于HPLC-MS代谢组学技术的女性首发精神分裂症机制研究

乔 颖 李华芳上海交通大学医学院附属精神卫生中心 上海 200030

· 论著 ·

基于HPLC-MS代谢组学技术的女性首发精神分裂症机制研究

乔 颖 李华芳△
上海交通大学医学院附属精神卫生中心 上海 200030

目的 采用基于HPLC-MS代谢组学技术研究女性首发精神分裂症患者血浆样品，鉴别精神分裂症患者血浆代谢产物变化及标志性代谢产物。 方法 以符合DSM-Ⅳ首发精神分裂症的女性急性期住院患者为病例组，女性健康志愿者为对照组，取2组患者血浆并进行基于HPLC-MS的代谢组学分析，寻找女性首发精神分裂症的生物标志物。 结果 与健康对照组相比，女性首发精神分裂症患者血浆代谢物产生明显变化，发现16个差异性的代谢产物。 结论 基于液相色谱-质谱技术的代谢组学研究发现女性首发精神分裂症患者存在氨基酸、能量及维生素E代谢紊乱。

精神分裂症；代谢组学；液相色谱-质谱；代谢通路

精神分裂症是由患者个体心理易感因素和外部因素刺激等多因素诱发的一组症候群组成的临床综合征，如思维障碍、感知聚障碍、意志和行为障碍、情感障碍以及认知障碍［13］。精神分裂症多发于青壮年，且病情多反复发作，是精神科的常见病、多发病。精神分裂患者一般需要终身服药，给家庭和社会带来沉重的经济负担和社会压力。但目前精神分裂症的发病机制尚未完全阐明。本文采用基于HPLCMS的代谢组学方法研究女性首发精神分裂症患者血浆样品，鉴别女性精神分裂症患者血浆代谢产物变化及标志性代谢物，对女性首发精神分裂症的分子机制进行研究，以期为精神分裂症患者体内复杂的代谢变化和临床诊断、治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取22例符合DSM-Ⅳ首发精神分裂症的女性急性期住院患者为病例组，病程1～17a，平均（8.0±4.86）a，年龄18～42岁，平均（29.4±7.20）岁。根据性别、年龄、身高、体质量、BMI等因素无显著差异原则纳入23例健康人群作为对照组，见表1。所有研究对象均无严重器质性疾病，体检、实验室及心电图检查均无临床意义的异常；所有研究对象排除妊娠及哺乳、药物过敏、酒精计药物依赖患者。

表1 2组一般资料比较

1.2 标本采集和保存 所有研究对象入院当晚未服用任何抗精神病药物，于次日06：30取血，样本均保存于-80℃冰箱。血清样品前处理：取100μL血清，加入300μL甲醇，涡旋3min，12 000r/min、4℃离心10min，取上清液即得供试品溶液。

1.3 仪器及试剂 仪器：液相色谱仪Agilent 1290Infinity UHPLC；质谱仪Agilent 6538UHD and Accurate-Mass QTOF/MS；色谱柱Waters ACQUITY UPLC＠HSS T3（1.8μm 100×2.1mm）。试剂：甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵购自美国默克公司（色谱级）；实验用水为屈臣氏蒸馏水。

1.4 样品的HPLC - MS方法测定 HPLC采用梯度洗脱，流动相：A-0.1%甲酸溶液，B-乙腈（0.1%甲酸）；流速0.4mL/min；柱温40℃；Post Time 6min；进样量4μL，洗脱浓度见表2。

表 2HPLC梯度洗脱程序

质谱条件：正离子模式：Gas Temp为350℃；Gas Flow 为11L/min；Nebulizer为45psi；VCap为4 000V；Fragmentor为120V；Skimmer1为60V；Octopole RF Peak为750 V；Reference Masses（m/z）为121.0509和922.0098。负离子模式：Gas Temp为350℃；Gas Flow为11L/min；Nebulizer为45psi；VCap为3 000V；Fragmentor为120V；Skimmer1为60V；Octopole RF Peak为750V；Reference Masses （m/z）为112.985587和1033.988109。

1.5 方法 稳定性考察分别将按前述处理条件处理的样品重复进样，考察系统及方法的稳定性。将血清样品按上述液相色谱-质谱条件，在正离子模式下重复进样6次，将质谱总离子流图重合考察实验方法的稳定性。为监测系统及方法的稳定性，在代谢组学实验时加入质控样品（QC）。每6个样品加入1个QC样品，结果发现该方法的稳定性良好。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差表示，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。样本中检测到的代谢产物由Marker View TM软件导出并合并峰表。矫正后的峰表代入SIMCA P11.0软件包进行最小二乘法判别分析，通过荷载图中的VIP值寻找生物标志物。将差异代谢物的精确分子量与网络数据库（HMDB、METLIN及KEGG）进行比对，同时对比标准物质以及MS/MS裂解碎片鉴别这些差异代谢物，最终确定精神分裂症潜在生物标志物及代谢途径。

2 结果

2.1 2组血浆HPLC-MS总离子流色谱图 按照前述色谱-质谱条件，对2组血浆样本分析，2组在正负离子模式下的总离子流图（TIC）如图1所示。

图1 正、负离子模式下对照组、疾病组总离子流图（TICs）A：正离子模式下健康对照组；B：正离子模式下疾病组；C：负离子模式下健康对照组；D：负离子模式下疾病组

2.2 2组主成分分析 为考察疾病状态下患者代谢标志物的变化情况，我们采用无监督的主成分分析（PCA）表征健康对照组和模型组的差异。结果发现，PCA得分图上对照组和病例组已有一定的分离趋势，如图2所示。

图2 2组PCA得分图A：正离子模式；B：负离子模式

2.3 潜在生物标志物的筛选和鉴别 为筛选与精神分裂症密切相关的生物标志物，本文采用有监督的偏最小二乘法-判别式分析（PLS-DA）得到正、负离子模式下PLS-DA的Score图、Scatter图（S-Plot）。结果发现，2组区分明显见图3。进一步通过student T-test，对2组差异变量进行统计学分析，得VIP＞1的差异代谢物。

图3 正、负离子模式下健康对照组和疾病组PLS-DA 的Score图，Scatter图A：正离子模式下Score图；B：正离子模式下Scatter图；C：负离子模式下Score图；D：负离子模式下Scatter图

2.4 精神分裂症潜在生物标志物及相关代谢通路分析 本文将差异代谢物的精确分子量与网络数据库（HMDB、METLIN及KEGG）进行比较，同时对比标准物质以及MS/MS裂解碎片鉴别这些差异代谢物，最终确定了16个物质为精神分裂症潜在生物标志物。16个标志物中上调表达9个，分别为L-亮氨酸、植物鞘胺醇、L-甲硫氨酸、2-氧代戊酸、乙酰丝氨酸、2-羟基戊酸及葡萄糖和α/δ-CEHC；下调表达的7个分别为3，4，5-三甲氧基肉桂酸、LysoPC（20：3）/（14：0）、PE（P-16：0/0：0）、甲苹果酸、N-乙酰-L-谷氨酰胺、PS（20：0/0：0）。

3 讨论

精神分裂症是临床精神科常见病、多发病，对患者的感情、思维、行为及知觉等多方面产生严重影响。精神分裂症是一种终身疾病，具有较高的致残率。精神分裂症的发病可能与患者的个体心理易感因素及社会外部因素刺激相关［45］。虽然目前临床上对精神分裂症患者以药物治疗为主，但对其发病机制尚未完全清楚。以符合DSM-Ⅳ首发精神分裂症的女性急性期住院患者为病例组，女性健康志愿者为对照组，取2组患者血浆并进行HPLC-MS的代谢组学分析，寻找女性首发精神分裂症患者的生物标志物，为相关的临床诊断及治疗提供参考。

精神分裂症患者由于不健康的生活习惯、生活方式的影响，经常存在糖、脂及氨基酸代谢紊乱［6-8］。食品中含有人体所必需的不同氨基酸及矿物质。目前，全球罹患精神疾病的人数不断上升，与人类饮食习惯改变、食用过多垃圾食品有关。精神分裂症的谷氨酸假说提出精神分裂症患者可能存在谷氨酸和甘氨酸等氨基酸神经递质的不足、谷氨酸-N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体功能减退。早期研究证实，精神分裂症患者脑脊液中的丙氨酸、甘氨酸及亮氨酸含量明显高于正常人。S-腺苷甲硫氨酸参与转甲基、转乙基及转氨基等多个反应，缺乏甲硫氨酸会导致抑郁症或老年痴呆等，且补充甲硫氨酸可改善帕金森病及阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病［9］。本文采用基于HPLC-MS的方法发现首发女性精神分裂症患者存在氨基酸代谢通路的异常，L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、乙酰丝氨酸、2-氧代戊酸表达上调，而N-乙酰-L-谷氨酰胺下调，与以往研究结果一致。同时，谷氨酸是大脑中最重要的兴奋性神经递质，也可在系统能量不足时转化为α-酮戊二酸进入TCA循环产生ATP，表明精神分裂症的发生也与能量代谢异常有关，与本文中发现葡萄糖是精神分裂症潜在代谢标志物一致。

精神分裂症的细胞膜学说提出细胞膜磷脂中的多不饱和脂肪酸代谢限速酶基因的变异可能导致精神分裂症的发生。本文发现，脂肪酸的代谢异常也与首发精神分裂症的发生有相关性，与精神分裂症相关的代谢标志物有2-羟基戊酸等，与以往研究证明的精神分裂症发病与脂肪酸代谢途径有关一致。本文发现α/δ-CEHC等与维生素E代谢有关的标志物明显上调，提示维生素E代谢通路也可能与精神分裂症的发病有关。因此，通过基于液相色谱-质谱技术的代谢组学研究，我们发现16个与女性首发精神分裂症有关的代谢标志物，可能与氨基酸、能量及维生素E代谢通路异常有关。

［1］Foruzandeh N，Parvin N.Occupational therapy for inpatients with chronic schizophrenia：apilot randomized controlled trial［J］.Jpn J Nurs Sci，2012，10（1）：136-141.

［2］Torres-Gonzalez F，Runte-Geidel A，Antonioli C，et al.Standardised measures of needs，stigma and informal care in schizophrenia using a bottom-up，cross-cultural approach［J］.Ment Health Fam Med，2012，9（2）：125-134.

［3］乔颖，李华芳.精神障碍的代谢组学研究进展［J］.中国临床药学杂志，2013，22（1）：33-37.

［4］闫丽华.首发精神分裂症患者治疗前期影响因素分析［J］.中国现代药物应用，2011，5（4）：237-238.

［5］柳波.精神分裂症患者发病前的心理社会因素分析［J］.中国实用医药，2011，6（16）：257-258.

［6］朱海兵，刘秀琴，王丹逢，等.首发精神分裂症糖脂代谢异常与血清肿瘤坏死因子-α的关系［J］.上海精神医学，2009，21（4）：206-208；224.

表3 2组血浆中显著差异代谢物及相关代谢通路分析

［7］Watanabe SY，Iga J，Numata S，et al.Association study of fat-mass and obesity-associated gene and body mass index in Japanese patients with schizophrenia and healthy subjects［J］. Clin Psychopharmacol Neurosci，2012，10（3）：185-189.

［8］夏旭兰，叶兴荣，董伟，等.男性住院精神分裂症患者糖代谢异常的8年随访［J］.临床精神医学杂志，2012，22（6）：422.

［9］王宏梅，赵心清.S-腺苷甲硫氨酸治疗精神神经系统疾病的现状与前景［J］.国外医学（老年医学分册），2007，28（2）：91-94.

（收稿2014-04-22）

Study of the pathogenesis of female with first onset schizophrenia by HPLC-MS

Qiao Ying，Li Huafang
Mental Health Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200030，China

Objective To study the pathogenesis of female with first onset schizophrenia through detecting the metabolites in plasma by HPLC-MS.Methods The plasma from all the research projects，normal project and female with first onset schizophrenia were analyzed by HPLC-MS in order to find out the biomarker related with the pathogenesis of female with first onset schizophrenia.Results Compared with control group，the metabolites in female with first onset schizophrenia were changed dramatically and 16biomarkers were discovered.Conclusion Abnormal metabolic pathways，including amino acid，vitamin E and energy metabolic were exists in female with first onset schizophrenia.

Schizophrenia；Metabonomics；HPLC-MS；Metabolic pathway

R749.3

A

1673-5110（2015）03-0001-03

上海市自然科学基金面上项目，编号13ZR1435800

△通讯作者：李华芳，博士生导师，主任医师，研究方向：精神药理学