神经酰胺通过JNK/c-Jun信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡

张露勇，张淼，刘师卜，李锐

神经酰胺通过JNK/c-Jun信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡

张露勇1，张淼2，刘师卜1，李锐3

目的 探讨神经酰胺对胶质瘤细胞87-MG和U251自噬性死亡的作用及机制。方法 采用MTT和流式细胞的方法检测不同浓度神经酰胺刺激87-MG和U251细胞后细胞存活和凋亡的改变；电镜和Western blotting技术检测自噬和JNK/c-Jun信号通路的改变，JNK药理性抑制剂SP600125特异性抑制JNK通路，观察其对神经酰胺诱导自噬死亡的影响。结果 神经酰胺刺激24 h后，87-MG和U251存活呈现时间依赖性下降(P＜0.05)；相应的细胞死亡数目剂量依赖性升高(P＜0.05)，但凋亡性死亡比例较低；神经酰胺刺激后镜下观察到的自噬小体计数，LC3B/LC3A和Beclin-1的表达以及JNK/c-Jun的磷酸化程度都增加(P＜0.05)。提前给予SP600125抑制JNK信号通路的活性后，可以阻断神经酰胺诱导的细胞自噬性死亡(P＜0.05)。结论 神经酰胺可诱导胶质瘤细胞87-MG和U251出现自噬性死亡，机制可能与JNK信号通路的活化有关。

胶质瘤；神经酰胺；自噬性死亡；JNK信号通路

[本文著录格式] 张露勇，张淼，刘师卜，等.神经酰胺通过JNK/c-Jun信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡[J].中国康复理论与实践,2015,21(8):905-912.

CITED AS:Zhang LY,Zhang M,Liu SB,et al.Autophagic cell death in glioma cell induced by ceramide through JNK/c-Jun pathway[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(8):905-912.

神经酰胺(ceram ide,Cer)是生物膜上 “脂筏”的结构基础，属于神经鞘脂类。此外，Cer作为第二信使发挥重要的生物学功能[1-2]。在肿瘤领域，Cer被认为是有效的预防剂/治疗剂，得到国内外专家学者的广泛关注。一些肿瘤的治疗药物和射线等都可以通过调节Cer的合成，最终促进肿瘤细胞的凋亡，发挥良好的抗肿瘤功能[3]。过去的研究提示，Cer可以活化多种信号通路，比如激酶抑制因子(kinase suppressor of Ras, KSR)/Raf、蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)和c-Jun的氨基末端蛋白激酶(C-Jun N-term inal kinase,JNK)等，最终诱导细胞的死亡[4]。另一项研究发现，Cer也可通过降低特定部位的黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)表达的水平，抑制肿瘤细胞的侵袭[5]。Cer既是JNK的激活剂，又参与细胞自噬的诱导[6]，然而JNK在Cer诱导肿瘤细胞的自噬性死亡中的关系尚未明确[7-8]。

1 材料和方法

1.1 材料

87-MG和U251细胞：中国科学院上海细胞所细胞库。Cer和MTT试剂盒：美国SIGMA公司。DMEM培养基：美国GIBICO公司。Annexin V/PI流式试剂盒：美国BD PHARM INGINE公司。抗JNK、phospho-JNK、c-Jun和phospho-c-Jun抗体：美国CELL SINGNALING公司。抗LC3抗体和工具药(SP600125和3-MA)：美国SIGMA公司。辣根酶过氧化物标记的山羊抗兔IgG二抗：美国SANTACRUZ公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物处理

87-MG和U251细胞常规培养于含有体积分数为10%胎牛血清、10 mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、100μg/m l青霉素、100μg/m l链霉素和3%谷氨酞胺的DMEM完全培养基中，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，1～2 d换1次液。细胞长满约90%后用胰酶进行消化，1∶4传代。3-MA和SP600125的终浓度分别为10mmol/L和10μmol/L，预处理细胞1 h后加入Cer(64mmol/L的DMSO储液，4℃保存)。

1.2.2 MTT法测定细胞活力

87-MG和U251细胞分别以3×103/孔的密度接种于96孔板，分别加入4μmol/L、8μmol/L、16μmol/ L、32μmol/L、64μmol/L的Cer，作用24 h后加入5 g/LMTT溶液，37℃培养4 h，弃去培养液。最后加入DMSO 0.2m l。待结晶溶解后，在570 nm波长处酶标仪测定吸光度值(A)和半抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentration,IC50)。

1.2.3 流式测定细胞凋亡

30μmol/L Cer刺激87-MG和U251，分别作用0 h、6 h、12 h、24 h后用胰酶消化。消化物1500 r/m in离心15min，加入AnnexinⅤ4μl和PI5μl，常温避光孵育15 min。上流式细胞仪测定(Becton Dickinson)，软件分析(cellquest)。

1.2.4 Western blotting

30μmol/LCer分别刺激87-MG和U251细胞6 h、12 h、24 h，弃培养基，PBS清洗2次，加细胞裂解液后冰上孵育15m in，收集细胞，4℃、12000 r/m in离心15m in，留取上清。用BCA蛋白定量后，加入4× SDS-PAGE上样缓冲液，100℃水浴10m in，对蛋白进行变性处理，-20℃保存备用。取总蛋白25μg的各组样品，SDS-PAGE电泳，PVDF转膜后封闭，1∶1000加一抗(anti-LC3；anti-Beclin-1；anti-JNK；anti-p-JNK；anti-c-JUN；anti-p-c-JUN；anti-GAPH)4℃孵育，次日1∶5000加入二抗，室温摇床2 h。最后ECL显色，暗室曝光。

1.2.5 电镜观察自噬小体

30μmol/L Cer处理87-MG和U251细胞24 h后，PBS洗3次，加入2.5%戊二醛溶液固定2.5～3 h。弃戊二醛，0.1mol/L的PBS洗3次。随后用1%饿酸后固定2 h。乙醇逐级脱水后用乙酸异戊酯替换细胞内酒精，临界点干燥后送电镜室。HITACHIH-7650型透射电镜观察自噬体、溶酶体的形态及数量，并摄片。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞存活率

不同浓度Cer作用24 h后87-MG(F=8.09,P＜0.05) 和U251(F=9.07,P＜0.05)细胞抑制率具有剂量依赖性；IC50分别为5.57μmol/L和15.27μmol/L，95%可信区间分别为(1.9×10-5,2.4×10-5)和(1.8×10-5,2.3×10-5)。见图1。

可见Cer对两种恶性胶质瘤细胞均有较强的抑制作用，且87-MG细胞的敏感性高于U251细胞。32 μmol/L Cer即可产生明显抑制细胞存活的作用(P＜0.01)，因此后续实验我们采用近似浓度(30μmol/L)进行检测，与本室前期机制相关实验保持一致。

2.2 细胞凋亡

随着Cer浓度的增加，两种细胞PI阳性率(坏死细胞)逐渐增加，作用1 h后即表现出显著性差异(F= 7.01,F=6.72,P＜0.05)。

Cer作用后，两种细胞的Annexin V阳性率(早期凋亡)均较低，且Cer作用后不同时间点，细胞早期凋亡无显著性差异(P＞0.05)。见图2。

2.3 细胞自噬水平

给药0 h、6 h、12 h、24 h后，LC3B/LC3A水平表达水平逐渐上调。作用12 h后，两种细胞的LC3B/ LC3A表达水平均明显高于0 h(F=8.59,F=7.31,P＜0.01)；87-MG中Beclin-1表达水平明显高于0 h(F= 9.85,P＜0.01)。作用24 h后，U251中Beclin-1表达水平明显增加(F=7.59,P＜0.01)。见图3A、3C。

给予3-MA后，LC3B/LC3A(P＜0.05)和Beclin-1的表达水平降低(P＜0.01)，见图3B、3D。肿瘤细胞死亡减少(F=5.09,P＜0.01)，见图4A、4B。电镜下可以观察到Cer诱导自噬小体数目的增加。见图4C、4D。

图1 不同浓度Cer对87-MG and U251细胞增殖的影响

2.4 Cer激活JNK/c-Jun信号通路促进自噬的发生

87-MG和U251细胞中JNK的磷酸化水平升高(F= 8.59,F=9.29,P＜0.01)，并随作用时间的延长激活作用越明显。JNK下游重要的转录因子c-Jun的磷酸化水平也明显上调(F=8.14,F=9.01,P＜0.01)，并具有时间依赖性。见图5A、5B。

应用JNK高选择性抑制剂SP600125预处理87-MG和U251细胞1 h后，联用SP600125与单用Cer相比，可以抑制JNK激酶的磷酸化(F=7.59,F=8.29, P＜0.05)，并减少LC3A向LC3B的转化(F=7.36,F= 7.39,P＜0.05)。见图6A、6B。

3 讨论

细胞死亡主要有程序性死亡和非程序性死亡两大类。近年来，自噬性死亡作为一种新的程序性死亡方式，成为生物学研究领域的热点。

自噬又被称为第二类程序性死亡，该过程首先是细胞形成双层膜结构包裹待降解物质形成自噬小体，后者与溶酶体结合形成自噬溶酶体，最终待降解物质在酶的作用下被降解清除。

自噬在肿瘤疾病的发生发展过程中发挥极为重要的作用。众多研究发现，多种治疗方法都可以激活肿瘤细胞的自噬过程，自噬被认为是抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞死亡的机制之一[9]。中枢神经系统的胶质瘤具有高发病率、高恶性的特点，至今公认的治疗手段是手术与放、化疗综合处理。但恶性较高的胶质瘤在术后易复发和转移，病患平均的生存时间只有13个月[10]。保守的药物治疗又很容易引起耐药性的出现。

综上所述，寻找新的药物靶点，对恶性胶质瘤的治疗十分关键。越来越多数据显示，自噬在药物抗肿瘤的过程中发挥关键作用，比如替莫唑胺[11]、姜黄素[12]、原人参萜二醇[13]等的抗肿瘤作用均与自噬的诱导有关。近年来有关Cer促进肿瘤细胞死亡的机制研究得到越来越多重视[14]，但其诱导细胞死亡的作用是否与自噬相关还不清楚。

我们前期的实验证明Cer可以活化下游的JNK信号，介导大鼠脑胶质瘤C6细胞的自噬性死亡。然而该细胞株不能代表所有的胶质瘤，有一定的局限性。为了进一步验证Cer诱导肿瘤细胞自噬性死亡的普遍性，我们进一步在不同遗传背景和不同敏感性的胶质瘤细胞中进行研究。

本实验发现Cer可剂量依赖性地降低87-MG和U251细胞的存活率，增加细胞的死亡率，与前期C6细胞系的结果相一致。但Annexin V-FITC/PI双染的数据提示，凋亡细胞只占死亡细胞的极少部分，因此推测Cer诱导的细胞死亡可能是凋亡之外的其他方式。

为了更好地研究自噬，自噬的检测方法尤为重要。自噬相关蛋白的检测是常用方法之一。如自噬相关蛋白LCA3向LC3B的转化，参与自噬小体的形成，LC3B/LC3As比值反映了细胞的自噬水平的高低[15]。Beclin-1也是自噬调节的一个重要基因，可以通过与Vps34/PI3K形成复合物参与自噬小体的形成[16-17]，Beclin-1的杂合性缺失被认为是肿瘤恶性转化的原因之一[18]。

图2 Cer对87-MG和U251细胞凋亡的影响

图3 Western blotting检测Cer对自噬相关蛋白LC3和Beclin-1水平的调控

图4 Cer通过促进自噬诱导87-MG和U251细胞的死亡

图5 Western bloting 检测Cer对JNK信号通路的影响

图6 JNK抑制剂SP600125逆转Cer诱导的87-MG and U251细胞自噬水平的增加

本研究发现，Cer作用时间的延长可以诱导87-MG和U251细胞LC3B和Beclin-1表达水平的升高，并具有时间依赖性，提示Cer可以诱导87-MG和U251通过自噬途径死亡，与流式细胞检测结果一致。在细胞应对外界刺激的过程中，Cer能够激活信号通路包括JNK并诱导细胞死亡[19]。实验数据提示，放射线和化疗药物作用于肿瘤后可以产生Cer，后者作为第二信使，可以活化下游JNK信号通路[5]。最新的数据还显示，JNK信号通路和细胞自噬也密切相关[20]。应用半胱氨酸酶(caspase)的药理性抑制剂zVAD抑制caspase-8，或者小干扰RNA沉默caspase-8，都可以激活纤维母细胞中JNK信号通路介导的自噬性死亡[8]。还有研究认为，JNK可以磷酸化Bcl-2的多个磷酸化位点，降解Bcl-2-Beclin1的复合物，游离Beclin-1，进而诱导自噬[21]。如上所述，JNK信号与自噬的关系十分密切，且是Cer下游的重要信号通路之一。在本项研究中，我们发现JNK信号的活化在Cer诱导胶质瘤细胞自噬的环节中发挥十分关键的作用。Cer能明显上调87-MG和U251细胞中JNK及其下游转录因子c-Jun的磷酸化程度。当借助JNK特异性抑制剂SP600125抑制JNK的活性后，Cer诱导的自噬激活被逆转。

综上所述，JNK可能是Cer诱导胶质瘤细胞自噬死亡的机制之一。Cer通过上调JNK信号通路，介导胶质瘤细胞发生自噬性死亡，为抗肿瘤药物的开发提供了新的思路。

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Autophagic CellDeath in G lioma Cell Induced by Ceram ide through JNK/c-Jun Pathway

ZHANG Lu-yong1,ZHANGMiao2,LIU Shi-bu1,LIRui3
1.Institute for Food and Cosmetics Control,National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100044,China; 2.Departmentof PharmaceuticalCare,Chinese PLAGeneralHospital,Beijing 100853,China;3.Departmentof Neurosurgery,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China

Objective To observe the autophagy of 87-MG and U251 glioma cells induced by ceramide and explore the possiblemechanism.Methods The viability and apoptosisof 87-MG and U251 cellswere detected by MTT assay and flow cytometry,respectively.Autophagic-related protein expressions of LC3B/LC3A and Beclin-1 were determined byWestern blotting.The activation of JNK/c-Jun signaling pathway induced by ceram idewith orwithout the treatmentof JNK specific inhibitor SP600125 was alsomeasured.Results 24 hours after treatmentof ceram ide,the grow th of 87-MG and U251 cellswas significantly inhibited time-dependently(P＜0.05);and the number of autophagic cells increased dose-dependently(P＜0.05).The levels of LC3B/LC3A and Beclin-1 significantly increased after ceram ide treatment(P＜0.05).JNK signaling pathway wasactivated in the87-MG and U251 cellsand the phosphorylation of c-Jun also increased after ceramide treatment.This activation of autophagy could be reversed by the pre-treatmentof SP600125.Conclusion Ceramidemay induce autophagy in 87-MG and U251 glioma cellsand themechanism may be related to the activation of JNK/c-Jun signaling pathway.

glioma cell;ceram ide;autophagic celldeath;JNK signaling pathway

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.08.007

R730.264

A

1006-9771(2015)08-0905-08

2015-04-08

2015-06-12)

1.中国食品药品检定研究院食品化妆品所，北京市100044；2.中国人民解放军总医院外科药房，北京市100853；3.中日友好医院神经外科，北京市100029。作者简介：张露勇(1980-)，男，汉族，山东荣成市人，硕士，助理研究员，主要从事食品、保健食品、化妆品的功能毒理评价研究工作。通讯作者：李锐(1971-)，男，汉族，云南昆明市人，主治医师，主要从事神经相关疾病的研究。E-mail:reedleer@sina.com。