白腐真菌对氯丹污染土壤的生物修复研究

杨东璇，肖鹏飞

(1.北京科技大学 土木与环境工程学院，北京 100083；2.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

白腐真菌对氯丹污染土壤的生物修复研究

杨东璇1，肖鹏飞2

(1.北京科技大学 土木与环境工程学院，北京 100083；2.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

在实验室模拟条件下，研究了白腐真菌Phlebia lindtneri GB1027对有机氯农药氯丹污染土壤的修复作用及影响因素。结果表明，白腐真菌在土壤中较少受到土著微生物的竞争影响，在灭菌和未灭菌土壤中对氯丹的去除率相差不大。木屑、秸秆和马铃薯均可作为营养物和生长载体促进白腐真菌对土壤中氯丹的降解，其中木屑的强化效果最佳，其次为秸秆。本试验条件下，白腐真菌接种量越大，对氯丹的去除效果越好，当接种量为15～20mL时生物修复效率最高。在氯丹浓度为5～100mg/kg的污染土壤中，菌株均显示出较好的修复效果，尤其对100mg/kg的氯丹的30d平均降解速率达到最高的1.71mg/(kg·d)。菌株对土壤温度和pH具有较宽的适应范围，污染土壤生物修复的最适温度范围是25～35℃，最适pH范围是4.0～6.0。本研究结果表明该白腐菌株具有应用于氯丹污染场地修复的潜力。

我国在上世纪曾大量生产并使用氯丹，虽然在上世纪80年代禁止其在农业上的使用，但仍然生产氯丹用于南方的白蚁防治。截止到2004年，我国共累计生产氯丹达到9 000t，其中1995～2004年十年间共生产氯丹5 400t[1]。为了履行《斯德哥尔摩公约》，我国关闭了大批氯丹等有机氯农药的生产企业，而企业原址在二次开发过程中，企业生产遗留下的污染场地的处理则成为了亟待解决的难题。有研究表明，氯丹生产车间表土中氯丹的浓度高达2 927.95mg/kg，且可通过迁移、扩散污染周围环境[2]。氯丹在土壤中残留期长、生物毒性强，如不对污染场地进行及时、有效地治理，将会对生态环境和人群健康造成潜在的威胁。

目前国内对于氯丹污染土壤的修复研究虽已有开展，但主要集中在微波修复[3-4]和淋洗修复[5-6]两类方法。生物修复技术因其成本低、无二次污染、环境友好等特点，成为有机污染土壤修复的关键技术[7]，但目前国内缺乏氯丹等有机氯农药污染土壤的生物修复研究。白腐真菌是一类能有效降解木素的丝状真菌，其降解酶系特异性较低，对多种难降解有机污染物都显示出一定的降解效果，使其在生物修复中具有良好的应用前景[8]。近年来，本课题组以白腐真菌为降解菌，在有机氯农药的生物降解方面开展了一些研究，发现部分白腐真菌及其酶系能在液相体系中高效降解氯丹，并将其转化为脱氯及羟基化产物，显示出一定的生物修复潜力[1,9-10]。应用微生物修复受污染环境需考虑诸多环境因子的影响，如共存微生物的竞争作用、接种量、污染物浓度、营养物质、温度及pH等，这些因素直接影响污染土壤的生物修复效率。本文针对国内对氯丹等有机污染土壤修复技术的需求，在前期研究的基础上，拟进一步考察白腐真菌对氯丹污染土壤的修复效果及影响因素，探讨白腐真菌应用于生物修复的可行性，为完善污染土壤的修复技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤：在东北林业大学林场采集表层黑土土壤样品，去除根茎、败叶、碎石等杂物，室内自然风干、研磨，过60目筛，备用。经测定，土壤中有机质含量为35.23g/kg，pH值为6.6，粘粒、粉粒和砂粒所占比例分别为63.2％、32.1％和4.7％。土壤中未检测出顺式或反式氯丹。

菌株及培养基：所用白腐真菌菌株Phlebia lindtneri GB1027由日本九州大学农学院近藤研究室提供。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L；马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠5g/L。

1.2 菌株培养

实验前，将在4℃斜面保存的菌种接种于含有15mL PDA固体培养基的平板培养皿中，30℃扩增培养5～6d，待长出的白色菌丝长满整个PDA培养基表面，将菌丝体刮下接种到无菌水中，轻轻振荡分散形成乳白色的孢子悬浮液并于4℃保存待用。取孢子悬浮液2mL接种于300mL的PDB液体培养基中，在气浴恒温振荡器上以30℃、150r/min下活化培养，定期注入氧气。定期用平板计数法测定菌悬液中的孢子数，达到每毫升106个时即可进行降解试验。

1.3 降解试验

称取20g土壤装入200mL锥形瓶，用喷雾法加入一定量配制好的反式氯丹的甲醇溶液，用无菌玻璃棒搅匀后制成人工模拟污染土壤，使氯丹初始浓度为50mg/kg。取其中部分锥形瓶于高温灭菌锅内121℃灭菌40min，冷却后在无菌室内按上述方法配制氯丹污染土壤。将锥形瓶置于室内使溶剂自然风干并放置2周后备用。土样中均匀添加5g木屑作为白腐真菌生长碳源和载体，并用以调节土壤空隙度。无菌条件下将上述培养好的菌悬液15mL接种到锥形瓶中。向锥形瓶通氧30s后密封，30℃条件下避光静置培养30d，定时补充水分以保持土壤含水率。每5d取样测定土壤中氯丹浓度。对照试验中接种的菌悬液预先进行高温灭菌处理(121℃、20min)，其他条件相同。实验结束后将土壤风干，4℃保存，待测。

1.4 降解条件试验

本试验设5个调控因子：菌悬液的接种量分别为2、5、10、15、20mL；共代谢底物选择木屑、粉碎秸秆或马铃薯块(0.5cm×0.5cm)；氯丹初始浓度分别为5、10、20、50和100mg/kg；温度分别设定为20、25、30、35和40℃；土壤pH分别设定为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0。以上每个处理做2个平行，试验重复2次。

1.5 样品处理与测定

取处理后的土壤样品置于索氏提取器中，锥形瓶用少量二氯甲烷清洗并倒入索氏提取器。加入200mL的二氯甲烷浸泡过夜后加入回收指示物，恒温水浴锅上连续提取12h。转移提取液并置于旋转蒸发仪上40℃下浓缩至近干，加入10mL正己烷以转换溶剂，进一步浓缩至2ml左右。通过硅胶/氧化铝层析柱进行分离净化，层析柱规格为25cm×1cm内径的玻璃柱，柱上层加有无水硫酸钠用以除水。样品上柱后，依次用15mL正己烷和70mL二氯甲烷/正己烷(3∶2，体积比)淋洗，将淋洗液混合并通过旋转蒸发仪浓缩后，置换溶剂为正己烷，用高纯氮气定容至0.5mL，转移至样品瓶中待测。

采用HP6890-HP5973气相色谱-质谱联用仪对氯丹进行定量测定。气相色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氦气，流量为1mL/min。进样口温度250℃，不分流进样，进样量1μL。升温程序为：起始温度80℃，保持2min后以15℃/min升至220℃，再以10℃/min升至300℃，保持2min。白腐真菌对氯丹的降解率计算公式为：降解率％=(对照土壤中氯丹的浓度-白腐真菌处理后土壤中氯丹的浓度)×100/土壤中氯丹的起始浓度

2 结果与分析

2.1 白腐真菌对灭菌和未灭菌土壤中氯丹的降解

为考察土著微生物对接种白腐真菌修复氯丹污染土壤的影响，研究了灭菌和未灭菌土壤中接种菌悬液对氯丹(50mg/kg)的降解情况。如图1所示，在灭菌土壤中，对照处理中氯丹浓度未显示出明显变化，避光、封闭处理条件也尽可能避免了氯丹的光解及挥发损失；而在接种白腐真菌处理中，氯丹的浓度随处理时间逐渐下降，但在前10d的降解率很低，说明白腐真菌需要自身调整来适应污染物的胁迫。经过适应期后，降解率逐渐增加，第20d和第30d的氯丹残留浓度分别只有30.2mg/kg和21.5mg/kg。在未灭菌土壤中，对照处理中氯丹浓度虽然呈现先不变后下降的趋势，但降解速度十分缓慢，至第30d仍有45.1mg·kg-1的氯丹残留在土壤中，表明在氯丹的胁迫下土著微生物产生了微弱的降解能力；而加菌处理后，土壤中氯丹的总浓度下降明显，但在处理前期，氯丹残余浓度却高于同一时间灭菌土壤中的浓度，这可能是接种菌作为外源微生物，与土著微生物之间产生的竞争作用，导致生理活性及降解效率受到一定程度的影响所致。然而，处理25d后，残余氯丹总浓度开始低于灭菌土壤，处理30d时的残留氯丹浓度只有19.3mg/kg，低于灭菌土壤处理的21.5mg/kg。可见随着处理时间的延长，土著微生物对白腐真菌降解氯丹的影响程度并不大。为了考察P.lindtneri GB1027在污染土壤修复中的作用，采用灭菌土壤进行后续研究。

图1 白腐真菌对灭菌和未灭菌土壤中氯丹的降解Fig.1 Degradation of chlordane by white rot fungus in the sterilized and uns-terilized soils

2.2 添加营养物的影响

分别选择木屑、粉碎秸秆及马铃薯块作为白腐真菌的营养物掺入土壤，考察其对氯丹污染土壤生物修复的强化效果。从图2可见，对照处理中，氯丹的降解速度较慢，处理一个月后仅仅13.4％的氯丹被白腐真菌所降解。实验过程中发现，对照处理中的土壤更容易板结成块，不利于为白腐真菌提供有利的生存条件。添加三种营养物的土壤中，氯丹降解速率明显加快，添加木屑、粉碎秸秆及马铃薯的处理体系中氯丹的降解率在第30d分别达到了58.6％、54.3％和35.7％，尤其是木屑和秸秆更能强化土壤中氯丹的白腐真菌降解。相比于马铃薯块，木屑和碎秸秆可以疏松土壤，增加土壤的透气性，有利于菌丝的生长及对土壤颗粒上氯丹的吸附降解。而在处理前期，木屑对白腐菌修复作用的促进效果则明显强于另两种营养物，表明木屑更加有利于土壤中白腐真菌的生长，从而有利于氯丹的去除。

图2 几种营养物对土壤中氯丹生物降解的影响Fig.2 Effects of wood dust,straw and potato on biodegradation of chlordane in soil

白腐真菌对营养物的要求不高，木屑、玉米芯、稻草、秸秆等廉价农业废弃物都可作为营养源支持其生长[11]。有研究表明，相比于培养在添加马铃薯成分的液体培养基，在添加了木材成分的培养基培养白腐真菌时几乎很少发生染菌的情况[12]。白腐真菌担子果大多在森林土壤中的腐朽木材上生长，木材既可作为白腐真菌的生长载体，又能提供白腐真菌生长所需成分，同时提高了白腐真菌在与其它微生物共存时的竞争能力。因此，在实际应用中，考虑修复效率与成本，使用木屑作为营养物强化白腐真菌修复污染土壤是比较理想的。

2.3 接种量的影响

接种量是决定生物修复效率的关键因素之一。外源微生物接种到土壤中会受到很多威胁，如与土著菌的生存竞争，受原生动物的吞食等，导致降解菌数量的减少。合适的接种量可以建立降解菌数量上的优势，提高土壤修复的效率[13]。本研究中，向污染土壤中分别接种2、5、10、15、20mL的菌悬液，考察不同白腐真菌接种量对修复氯丹污染土壤的影响。结果如图3所示，不同接种量的白腐真菌对土壤中的氯丹都具有一定的降解作用，但降解效果有所不同。在接种量为2和5mL时，处理前期由于接种量少，氯丹降解速率较慢，处理后期降解速率加快，在第30d时的降解率分别达到22.5％和29.7％。而随着接种量的增大至10和15mL，氯丹降解速率明显加快，30d降解率分别达到了42.1％和54.3％。研究表明，高的接菌量可保证足够的存活率和一定的种群水平，起到快速降解的效果。当接种量进一步增至20mL时，降解效果和接种量为15mL时相比增加不多。这是由于当接种量达到一定程度时，菌体与底物已经充分接触，此时接种量已近饱和，不再是制约氯丹降解的主要因素。若继续增加接种量可能会导致种间竞争，出现营养不足的现象，一定程度上影响降解效果。因此，该试验条件下接种量控制在15mL左右对于发挥降解菌的修复效果是比较合适的。

图3 菌液接种量对土壤中氯丹生物降解的影响Fig.3 Effects of inoculum amount on biodegradation of chlordane in soil

2.4 氯丹初始浓度的影响

在其它试验条件相同的情况下，考察了白腐真菌对不同浓度氯丹污染土壤的修复效果。结果如图4所示，在所有初始浓度条件下氯丹残余浓度均随时间而有所下降，且呈现出近似线性的变化。在氯丹初始浓度分别为5、10、20、50和100mg/kg时，处理30d后的降解率分别达到72.0％、67.0％、69.5％、57.6％和48.3％；而平均降解速率分 别 为 0.12、0.23、0.51、1.06 和1.71mg/kg·d。从降解率上看，当氯丹初始浓度在5～20mg/kg时的降解率明显高于50和100mg/kg时的降解率。在菌株接种量一定的条件下，底物浓度较低时，绝大多数的底物都会迅速与菌体接触，从而被吸附、降解；随着底物浓度的升高，底物分子会竞争性地与降解酶活性中心相结合，使部分底物被排除在外，导致降解速度有所减缓，这可能是氯丹初始浓度较高时降解率降低的原因。然而，在高浓度污染场地修复过程中，污染物的平均去除速率和去除总量是评价修复效率的重要指标。在本研究中，无论是氯丹的平均降解速率还是降解总量，在试验浓度范围内均呈现出随初始浓度的增加而增加的趋势，即在100mg/kg时最高。因此，如果延长处理时间，仍可将残余在土壤中的氯丹进一步降解去除。以上结果可见，在该处理条件下，白腐真菌不仅能有效去除土壤中低浓度的氯丹，对高浓度氯丹也有较好的降解去除效果。

图4 初始浓度对土壤中氯丹生物降解的影响Fig.4 Effects of initial concentration on biodegradation of chlordane in soil

2.5 土壤温度的影响

在生物修复过程中，温度条件直接影响着微生物的生长及降解酶的活性，进而影响着对污染物的降解去除效果。因此，选择合适的土壤温度对于提高污染土壤的修复效率至关重要。本文研究了不同温度条件下白腐真菌对土壤中氯丹的降解情况(图5)。结果显示，在25～35℃范围内，氯丹的降解效果较好，30d的降解率均超过了53.5％。30℃处理时对氯丹污染土壤的修复效果最佳，接近60％。在20～30℃范围内，氯丹的降解率随温度升高逐渐升高；而30～40℃范围内，氯丹的降解率随温度升高逐渐下降。不同温度条件下的降解效果虽然有所差别，但从降解曲线可见，降解率在不同温度间的变化幅度较缓，即使在20℃和40℃时，土壤中氯丹的降解率仍能保持在45％左右，可见该白腐真菌对土壤温度的适应范围较大，具备野外污染场地的修复潜力。

图5 温度对土壤中氯丹生物降解的影响Fig.5 Effects of temperature on biodegradation of chlordane in soil

2.6 土壤pH值的影响

同温度条件一样，土壤pH值也是影响生物修复过程中微生物及其酶活性的关键因素之一。试验结果显示(图6)，土壤pH值在4.0～6.0范围内时，氯丹的降解率保持在较高的水平，30d降解率均在56.7％以上，表明在该白腐真菌在弱酸条件下对氯丹的降解活性较强。该菌株的最适pH值为5.0，处理30d后氯丹的降解率达到59.3％。当pH值达到7.0和8.0时，氯丹的降解率分别降至50.9％和44.6％，可见在中性及碱性条件下不太适合菌株发挥最佳的降解效果。这可能是由于不适的土壤pH值使微生物的生长受到抑制，或使降解酶分子构型发生变化，导致降解活性下降。但总体来说，降解菌对土壤pH值的变化具有一定的适应能力，即使在pH值为8.0时，氯丹的降解效果仍可维持在最适pH值条件下的75％左右，即该试验菌株具备在不同酸碱度条件下修复氯丹污染土壤的能力。有研究表明[14]，白腐真菌在生长过程中具有调节pH值的能力，即使在非最佳生长pH值条件下，也能通过自身的生理功能分泌一些酸碱性物质来调节土壤pH值，使其达到适于自身生长的范围。

图6 pH对土壤中氯丹生物降解的影响Fig.6 Effects of pH on biodegradation of chlordane in soil

3 结 论

(1)白腐真菌P.lindtneri GB1027在灭菌土壤和未灭菌土壤中都能有效地降解氯丹，且在30d内降解率相差不大，表明该菌株能克服土著微生物的竞争效应，用于处理受氯丹污染的土壤是可行的。

(2)木屑和秸秆相比于马铃薯更适合作为白腐真菌生长的营养物质及生长载体，促进对土壤中氯丹的降解，尤其是木屑的强化效果最好；本试验条件下，菌液接种量为15mL时对污染土壤的修复效果最好，继续增加接种量对修复作用的强化效果不明显；经过30d处理，菌株对土壤中浓度为5～100mg/kg的氯丹均具有较好的降解去除效果，初始浓度为最高的100mg/kg时，平均降解速率达到最高的1.71mg/kg·d。

(3)白腐真菌修复氯丹污染土壤的最适温度范围是25～35℃，最适pH值范围是4.0～6.0；虽然温度和pH值对修复效率有一定的影响，但菌株对土壤温度和pH值具有较宽的适应范围，具有适用于污染场地修复的潜力。

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Bioremediation of chlordane-contaminated soil by white rot fungus

YANG Dong-xuan1,XIAO Peng-fei2
(1.School of Civil and Environmental Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083 China; 2.College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,Heilongjiang,China)

The bioremediation of chlordane-contaminated soil by white rot fungus Phlebia lindtneri GB1027 and the factors affecting the remediation capacity were investigated under the lab.simulated conditions.In sterilized soil,the degradation rate of chlordane after 30 days of incubation was similar to that those in un-sterilized soil.The removal of chlordane by fungus from soil could be effectively enhanced by addition of wood dust,crushed straw and potato,and the sequence of removed rates was wood＞straw＞potato.The removal rates of chlordane from soil increased gradually with the increase in inoculum amount of P.lindtneri GB1027,and the higher removal rates of chlordane were found from soil with a high inoculum amount of 15～20mL.The strains all showed good repair results in the chlordane-contaminated soil with contaminated concentrations(5～100mg/kg),and the greatest degradation rate of chlordane was 1.71mg/(kg·d)with initial chlordane concentration of 100mg/kg after 30 days.P.lindtneri GB1027 had higher degradation rates(53.5％～59.3％)when the temperature ranged from 25 to 35℃,and the pH value ranged from 4.0 to 5.0.The results indicate that the strains have the potential to apply to chlordane contaminated sites remediation.

white rot fungus; chlordane; chlordane-contaminated soil; bioremediation

S718.51+6

A

1673-923X(2015)07-0105-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.03.019

2014-01-10

国家自然科学基金项目(41201307)；人社部留学回国人员科技活动择优资助项目

杨东璇，主要从事环境工程方面的研究

肖鹏飞，博士，E-mail：xpfawd@nefu.edu.cn

杨东璇,肖鹏飞.白腐真菌对氯丹污染土壤的生物修复研究[J].中南林业科技大学学报,2015,35(3)：105-109,114.

[本文编校：吴 毅]