柱前衍生-反相高效液相色谱法检测富硒米曲霉中有机硒形态

李红卫，王开萍，吴 娱，唐正江，汤 飞，刘国庆,2,*

（1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.安徽省皖江禽产业研究院，安徽 宣城 242000）

柱前衍生-反相高效液相色谱法检测富硒米曲霉中有机硒形态

李红卫1，王开萍1，吴 娱1，唐正江1，汤 飞1，刘国庆1,2,*

（1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.安徽省皖江禽产业研究院，安徽 宣城 242000）

建立高效液相色谱法测定富硒米曲霉中有机硒形态的分析方法。采用6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解富硒米曲霉48 h，提取样品中的有机硒，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离，以乙腈-水（1∶1，V/V）和pH 6.8乙酸-乙酸钠缓冲液为流动相进行梯度洗脱，紫外检测波长：240 nm，测得富硒米曲霉中有机硒化合物主要是硒代胱氨酸，检出限（RSN=3）为0.680 mg/L，定量限（RSN=10）为2.244 mg/L，线性范围为5.0～100 mg/L，加标回收率为94.8%～105.8%，硒代胱氨酸的含量为1.25 mg/g。本方法简单、灵敏、重复性好，可适用于富硒米曲霉及相关产品中有机硒形态的检测分析。

富硒米曲霉；有机硒；硒代氨基酸；柱前衍生-反相高效液相色谱法

硒是人和许多生物体必需的微量元素，对生物体的健康具有重大意义。市面上出现了许多富硒产品，如酵母硒、植物硒以及一些富硒食用菌等，其品质的高低不仅取决于硒的含量，还与硒的形态有着密切关联。研究[1-2]表明：无机硒生物活性、利用率较低，不易被肠道吸收，还具有一定毒性，摄入过量会导致急性、慢性中毒；与无机硒相比，有机硒是经生物转换而得，具有毒性小、生物利用度高的特点，并且硒的所有生物学功能均是通过硒蛋白来调控和实现的，因此有机硒相较于无机硒对生物体来说，更为重要。

米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等，被广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用1 000多年。潘艳[3]利用米曲霉作为富硒载体，在其培养基中加入无机硒，利用生物转化将难吸收的无机硒源转化为易吸收的有机硒源[4]，发酵生产富硒米曲霉，测得摇瓶发酵的富硒量达2.512 mg/g，分批发酵的富硒量更是高达3.3 mg/g，远高于富硒酵母的1.0～2.0 mg/g硒含量。现阶段关于富硒酵母、植物硒和一些其他富硒产品中硒形态[5-7]的研究已经较为完善，但富硒米曲霉中硒形态的研究这一领域仍然比较缺乏，因此建立一种分析富硒米曲霉中硒形态及含量的方法，不仅可以为该领域的研究提供一定的理论依据，也对评价其营养价值具有重要意义。与此同时，还能够对开发高产、优质的富硒米曲霉保健品起促进作用。

近些年来，国内很多研究者对富硒样品中硒的形态做了大量研究。陈尚卫等[8]采用酶解提取法提取，氯甲酸乙酯衍生，气相色谱-串联质谱（gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS-MS）联用法选择离子模式对富硒酵母中的硒代蛋氨酸进行检测；刘扬等[9]采用蛋白酶提取富硒酵母中的有机硒，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（high performance liquid chromatographyinductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ΙCPMS）联用法检测其有机硒的形态；Deng Biyang等[10]采用稀酸提取，毛细管电泳-电化学发光（capillary electrophoresis coupled with electrochemiluminescence，CE-ECL）法检测富硒酵母中硒代蛋氨酸；仲娜[11]采用微波消解法提取市场上出售的富硒大米、富硒茶叶、富硒螺旋藻、富硒大葱、富硒鸡蛋中的有机硒，HPLC-ΙCPMS测其硒形态。以上这些方法，HPLC-ΙCP-MS联用仪器昂贵，普及度不高，样品预处理繁琐，分析成本较高；CE-ECL方法中电泳的重现性不高，影响定性定量结果。考虑到以上这些因素，并且目前关于富硒米曲霉中硒形态的研究也较少，本实验针对其硒形态的分析建立一种方法，采用酸水解法进行样品提取，并用4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯（4-chlorine-3,5-dinitrobenzotrifl uoride，CNBF）对样品提取液进行衍生，衍生过后直接运用反相高效液相色谱法对样品中的有机硒化合物形态和含量进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒米曲霉（硒含量2.325 mg/g） 实验室自制。

标准样品：硒代甲硫氨酸（SeMet，98%，CAS：3211-76-5）、硒代胱氨酸（SeCys2，97%，CAS：29621-88-3） 美国Sigma公司；衍生剂：CNBF 美国阿拉丁公司；超纯水、pH 7.0磷酸缓冲液、pH 9.0硼砂-硼酸缓冲液、pH 6.8乙酸-乙酸钠（0.05 mol/L）缓冲液、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、0.08 mol/L NaOH、 6 mol/L HCl溶液。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪配紫外检测器 美国Waters公司；超微电子天平 德国Sartorius公司；SE812氮吹仪北京帅恩科技有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 巩义市予华仪器有限责任公司；恒温水浴锅国华电器有限公司；HC-3518型高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；PHS-3C型精度酸度计 上海大普仪器有限公司；WH-861型涡旋振荡器 太仓市科教仪器厂；超声波清洗器 昆山超声波仪器有限公司。1.3 方法

1.3.1 标准储备溶液的配制

分别称取适量的SeMet和SeCys2标准品，用超纯水制0.1mg/mL的标准品储备液，溶液置于4 ℃冰箱中保存备用，保存期限一个月。

1.3.2 样品预处理

准确称取0.3g经液氮研磨的富硒米曲霉粉末4 份置于10 mL的离心管中，加入5 mL 6 mol/L HCl溶液，用氮气吹10 min后封口。一份在110℃条件下水解24 h，另外3 份在50℃条件下分别水解24、48、72 h。离心15 min后取上清液，用超纯水定容至100 mL备用。

1.3.3 样品的衍生

取3 mL样品溶液，加入2 mL pH 9.0硼砂-硼酸缓冲液和100 μmol/mL的CBNF衍生剂2 mL，封口，在65 ℃水浴条件下衍生40 min，反应结束后取出冷却，放置至室温，振荡，用pH 7.0磷酸缓冲液定容至10 mL后振荡30 s，再静置10 min。用0.22 μm有机过滤器过滤至上机小瓶，待用。

分别取0.1 mL的SeMet和SeCys2标准溶液储备液按照如上方法进行衍生。其反应机理[12]见图1。

图1 SeMet与CNBF（a）、SeCys2与CNBF（b）和CNBF自身水解（c）反应机理图Fig.1 (a) Reaction scheme of CNBF with amine groups on SeMet; (b) Reaction scheme of CNBF with amine groups in SeCys2; and (c) hydrolysis of CNBF reagent

1.3.4 色谱条件

色谱柱：We l c h U l t i m a t e C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：乙腈-水（1∶1，V/V）；流动相B：0.05 mol/L，pH 6.8乙酸-乙酸钠缓冲液；柱温：31 ℃；检测波长：240 nm；流速1.2 mL/min；梯度洗脱：0～25 min，65% A、35% B；25～30 min，75% A、25% B；30～34 min，90% A、10% B；34～40 min，100% A、0% B。

2 结果与分析

2.1 硒代氨基酸提取方法的选择

富硒米曲霉中硒代氨基酸是有机硒的主要形式，而有机硒主要存在于蛋白中，故采用水解蛋白的方式提取富硒米曲霉中的硒代氨基酸。目前蛋白水解的方式主要以酸水解法为主，但是普通的酸水解条件为110 ℃条件下水解24 h，在该方法中甲硫氨酸、胱氨酸/半胱氨酸常常会遭到破坏，易造成损失[13]。郝素娥等[14]采用6 mol/L的HCl溶液，50℃水解50 h的方法提取富硒酵母中的硒化合物，有机硒提取率达到61.3%；唐莹莹等[15]用6 mol/L的HCl溶液提取富硒大米中的硒化合物，提取时间分别为24、48 h，相对应的提取温度为110 ℃和50 ℃。结果显示50 ℃条件下提取48 h所得的硒化合物含量高于110 ℃条件下提取24 h的量。因此本实验预建立一种条件温和且操作简单的前处理水解法，即降低水解温度对富硒米曲霉中的硒代氨基酸进行提取，并且比较了不同水解时间条件下，有机硒的提取量，其结果见表1。

表1 富硒米曲霉中硒化合物的测定Table1 The contents of selenium compounds in selenium-enriched Aspergillus oryyzzaaee

由表1可知，4 种水解方法相比较而言，50 ℃、24 h的水解条件下，提取的SeCys2的量最低，仅为1.12 mg/g，推测可能是由于蛋白未水解彻底导致；50 ℃、72 h条件下的最高，为1.27 mg/g，比110 ℃水解24 h的1.18 mg/g高7.6%，并且略高于50℃、48 h条件下的1.25 mg/g，SeMet均未检出。综合考虑实验条件与实验时间，选取反应条件较温和，反应时间较短的50℃、48 h为本实验的水解条件。

2.2 衍生条件的优化

2.2.1 衍生剂的选择

SeMet、SeCys2及大部分氨基酸本身并不能产生紫外吸收，必须经过衍生化反应，产生具有紫外吸收的衍生物才能被检测。目前国内外应用较广泛的衍生剂有邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）[16-17]、异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PΙTC）[18]、2,4-二硝基氟苯（dinitrofluorobenzene，DNFB）[19]、丹酰氯（Dansyl-Cl）[20]、6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚胺基甲酸酯（6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate，AQC）[21-22]、9-芴甲基氯甲酸酯[23-24]和CNBF等。

虽然衍生剂的种类很多，但没有哪一种衍生剂能够完全适合所有氨基酸的分析[25-27]。例如，OPA衍生法具有衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定等优点，缺点是只能与一级氨基酸反应，二级氨基酸不能与其直接反；Dansyl-Cl法可同时检测包括亚氨基酸在内的所有氨基酸，缺点是流动相中的杂质和衍生副产物对测定有干扰；DNFB法的优点有衍生产物稳定、操作简便、成本低等，衍生产物由于硝基苯环的引入，有较强的紫外吸收，因此具有较高的灵敏度，缺点是衍生过程中产生的副产物干扰测定，限制了DNFB在氨基酸分析中的应用；PΙTC法可同时测定伯氨酸和仲氨酸，衍生产物单一、稳定，缺点是PΙTC毒性大，且极易损耗色谱柱寿命。CNBF衍生条件为65 ℃条件下衍生40 min，与以上衍生剂相比具有反应条件温和、衍生时间短、成本低等优势，因此本实验采用CNBF做衍生剂进行硒代氨基酸的检测。

2.2.2 衍生剂用量对衍生效率的影响

为使衍生反应完全，一般需要加入过量的衍生剂。实验了不同用量衍生剂对衍生效率的影响，当反应温度65 ℃、反应时间40 min时，随着衍生剂用量的增大，色谱峰面积增大，一般当衍生剂用量大于20 倍理论量时，峰面积不在变化，衍生反应接近完全。本法选择3.0 mL样品溶液加入2 mL 100 mmol/L的CNBF衍生剂进行衍生反应，约相当于硒代氨基酸标准品量为0.1 mg/mL时的40 倍（考虑到CNBF自身的水解反应）理论量。

2.2.3 衍生化反应时间的选择

在保持衍生反应缓冲液pH值和衍生剂用量不变的情况下，于65 ℃水浴中分别衍生反应不同时间（30～60 min），观察反应时间对色谱峰面积的影响。结果表明，随着反应时间的延长，色谱峰面积呈上升趋势，反应40 min后，硒代氨基酸的色谱峰面积已趋于最大。故本法选用40 min作为反应时间。

2.2.4 衍生反应缓冲液pH值的选择

选用硼砂-硼酸缓冲液，比较不同pH值条件下（pH 8.6～11.0）进行衍生反应对硒代氨基酸峰面积的影响。结果表明，在pH 9.0时硒代氨基酸的峰面积最大。故将衍生介质的pH值定为9.0。

2.3 色谱条件的优化

SeMet和SeCys2与CNBF发生衍生化反应，衍生物在240 nm处产生紫外吸收。考虑到富硒米曲霉中含有其他氨基酸对硒代氨基酸的测定产生一定的干扰，采用乙腈-水（1∶1，V/V）和0.05 mol/L，pH 6.8乙酸-乙酸钠缓冲液为流动相，根据米曲霉的特性对梯度洗脱的方法进行优化，最终在1.3.4节色谱条件下，使富硒米曲霉中的硒代氨基酸得到良好的分离。图2为SeMet和SeCys2标准品的衍生色谱图。

图2 SeMet与SeCys衍生物的液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of the CNBF-SeMet and SeCys2derivatives

2.4 富硒米曲霉样品的衍生色谱分析

图3 富硒米曲霉水解色谱图Fig.3 Chromatogram of hydrolysate of selenium-enriched Aspergillus oryzae

富硒米曲霉在6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解48 h后得到的产物进行衍生反应后的色谱分析如图3所示。SeCys2得到了有效分离，但SeMet未出现明显的色谱峰，可能是由于富硒米曲霉中含量过低或者是此提取方法对于SeMet的提取具有一定的局限性，具体原理有待进一步研究。图中其余未标色谱峰可能是其他物质，由于缺少明确的标准物质，暂时无法确定。

2.5 方法的线性范围与方法检测限

取硒代氨基酸标准品储备液逐级稀释成5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100 mg/L的系列标准工作液，按上述试验方法衍生后上机测定，以硒代氨基酸浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标做标准曲线，其检测限及线性范围见表2。

表2 硒代氨基酸的检测限及线性范围Table2 Linear calibration ranges, regression equations, R2, LOD anndd LOQ of CNFB-selenoamino acids derivatives

由表2可知，SeMet标准曲线y=12 059x-63.538，R2=0.997 5，测定质量浓度在5.0～100 mg/L内线性关系良好；SeCys2标准曲线y=17 432x-87.428，R2=0.992 8，测定质量浓度在5.0～100 mg/L也具有良好的线性关系，均可用于样品的检测分析。SeMet最低检测限为0.41 mg/L，定量限为1.35 mg/L，其检测灵敏度高于SeCys2的0.680 mg/L，高出39.7%，定量限也高于SeCys2的2.244 mg/L，高出66.2%。

2.6 方法的重复性及加标回收率实验

取同一份富硒米曲霉样品5 份，按照上述方法测定硒代氨基酸含量，5 次结果的相对标准偏差均小于5%，表明该方法重复性良好。

取富硒米曲霉样品4 份，加入不同量SeCys2标准液，按照实验方法测定，计算加标回收率。由表3可见，SeCys2有较高的加标回收率，为94.8%～105.8%，使得有机硒的测定真实可信，满足富硒米曲霉测定的需要。

表3 富硒米曲霉中SeCCyyss2的加标回收率Table3 Spiked Recovery of SeCys2in selenium-enriched Aspergillus oryyzzaaee

3 结 论

实验研究确立CNBF柱前衍生-反相高效液相色谱法检测富硒米曲霉中有机硒形态的分析方法。重点对样品的提取方法和衍生方法进行了研究。1）样品的提取方法研究：比较不同温度、不同时间对提取富硒米曲霉中硒代氨基酸的影响，并综合考虑实验条件的选取与实验时间的消耗，采用一种温和的实验条件-6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解48 h的方法，提取样品中的硒化合物，在确保实验定性定量结果的同时，提高了富硒米曲霉中硒代氨基酸的提取效率。2）硒代氨基酸衍生及分离研究：选择CNBF柱前衍生，并对衍生剂用量、衍生时间以及衍生反应缓冲液的pH值进行了优化，采用乙腈-水（1∶1，V/V）和pH 6.8乙酸-乙酸钠缓冲液为流动相进行梯度洗脱，使SeMet和SeCys2得到有效分离。该实验方法的检测限低、精密度高，线性相关性良好，加标回收率在94.8%～105.8%之间。与现在较为先进的HPLC-MS联用分析硒代氨基酸的方法相比，具有普及性强，样品处理简单，对实验设备要求低，同时兼顾准确性与经济性的优势，基本可以满足硒形态分析的要求，能够用于硒形态分析研究。

但同时实验尚有不足，有待改进的地方。从色谱图可以看出，目标物的出峰时间太晚，耽误检测效率，是否可以通过某些手段，使目标物的出峰时间提前，缩短检测时间，提高实验效率等，本课题组还将会对此领域的研究做进一步的探索。

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Determination of Organic Selenium Compounds in Selenium-Enriched Aspergillus oryzae by Pre-Column Derivatization-RP-HPLC Method

LI Hongwei1, WANG Kaiping1, WU Yu1, TANG Zhengjiang1, TANG Fei1, LIU Guoqing1,2,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Anhui Wan Jiang Poultry Industry Research Institute, Xuancheng 242000, China)

A reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for the determination of organic selenium compounds in selenium-enriched Aspergillus oryzae was established. The extraction of organic selenium compounds from samples was performed through hydrolysis with 6 mol/L HCl solution for 48 h at 50 ℃. After pre-column derivatization with 4-chlorine-3,5-dinitrobenzotrifl uoride (CNBF), the derivatives were separated on a C18reversed-phase column through gradient elution with acetonitrile-water and pH 6.8 acetic acid-sodium acetate buffer solution. UV detection was carried out at 240 nm. The organic selenium compound in selenium-enriched A. oryzae was mainly selenocystine (SeCys2). The limit of detection (LOD) (RSN= 3) was 0.680 mg/L and the limit of quantitation (LOQ) (RSN= 10) was 2.244 mg/L. The linear range was 5.0-100 mg/L. The recoveries were in the range of 94.8%-105.8% and selenium-enriched A. oryzae contained 1.25 mg/g selenocystine. This method is simple, sensitive and accurate, and could be used to determine organic selenium compounds in selenium-enriched A. oryzae and related products.

selenium-enriched Aspergillus oryzae; organic selenium; selenoamino acids; pre-column derivatization-RP-HPLC

Q517

A

1002-6630（2015）22-0137-05

10.7506/spkx1002-6630-201522025

2015-01-07

安徽省科技攻关项目（1401032006）

李红卫（1988—），男，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。E-mail：li3017545@163.com

*通信作者：刘国庆（1963—），男，教授，博士，研究方向为生物技术。E-mail：liugq_168@163.com