补阳还五汤对脑缺血大鼠血清TNF-ɑ、IL-6、CRP的影响研究*

吴 旋汪 欣陈云欢蔡梅玉程 颖

补阳还五汤对脑缺血大鼠血清TNF-ɑ、IL-6、CRP的影响研究*

吴 旋①汪 欣①陈云欢①蔡梅玉①程 颖①

目的：探讨补阳还五汤对MCAO（大脑中动脉线栓法）大鼠血清TNF-ɑ、IL-6、CRP的影响。方法：60只大鼠随机分为四组：假手术组、模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤高剂量组。Garcia JH评分标准评价受试大鼠的神经功能，化学发光法检测大鼠外周血清TNF-a、IL-6的水平，免疫比浊法检测大鼠血清CRP水平。结果：术后第7天，补阳还五汤低剂量组和高剂量组大鼠神经功能得到一定程度的恢复，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），同时低剂量组和高剂量组比较差异也有统计学意义（P＜0.05）。补阳还五汤低剂量组、高剂量组的TNF-a与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组的IL-6、CRP与模型组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；高剂量组的IL-6、CRP与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：补阳还五汤可下调MCAO大鼠TNF-a、IL-6、CRP水平，通过减轻炎症作用，达到神经保护的作用。

补阳还五汤； 神经功能； 炎症因子

脑缺血是临床上心脑血管的多发病，具有较高的致残率和致死率，如何在发病早期予以早期干预是目前临床面临的一个重要难题。补阳还五汤出自清代王清任《医林改错》，是临床上治疗脑缺血的重要方剂，然而其作用机制仍不明确。为深入探讨其机制，本实验采用大脑中动脉线栓法（MCAO）建立大鼠脑缺血模型，采用补阳还五汤进行灌胃治疗，观察补阳还五汤对MCAO大鼠外周血炎症指标TNF-ɑ、IL-6、CRP的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 清洁级成年Wistar大鼠60只，雄性，100～150 g，购自福建中医药大学动物实验中心。大鼠在实验动物中心适应性喂养1周，待体重达到250～300 g开始进行干预、造模等工作。60只大鼠随机分成四组：（1）假手术组：15只，假手术后，常规饲养于笼内，不进行任何干预治疗；（2）模型组：15只，造模后常规饲养于笼内，不进行任何干预治疗；（3）补阳还五汤低剂量组：15只，5 g/（kg·只）（按体表面积算相当于成人等效剂量），1次/d，造模前灌胃7 d，造模后继续灌胃7 d。（4）补阳还五汤高剂量组：15只，25 g/（kg·只）（按体表面积算相当于成人等效剂量的5倍），1次/d，造模前灌胃7 d，造模后继续灌胃7 d。

1.2 补阳还五汤制备 补阳还五汤各单味药购自北京康仁堂药业有限公司，严遵照原方配比而成，含生黄芪120 g，当归尾6 g，赤芍4.5 g，地龙3 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g。中药饮片的质量标准参照《中国药典》2010年版。按2006年7版《中药药理研究学》制备补阳还五汤水煎液，由福建中医药大学附属康复医医院药剂科完成：加水500 mL浸泡30 min，武火煎煮沸腾后改用文火加热30 min收取1次药液，再加水500 mL煎煮，方法同前，去药渣后用滤纸过滤，将2液混合加热浓缩，使生物药浓度为1.2 g/mL，置于4 ℃下冷藏备用。

1.3 动物模型制备 术前禁食12 h，用3.4％水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上，参照文献[1]，采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型：颈部正中切开皮肤及浅筋膜，钝性分离右侧胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌之间的肌间隙，掀起右侧胸骨舌骨肌的外侧缘，即可见内下方的颈总动脉（CCA）与迷走神经。快速游离CCA，在距颈动脉分叉约5 mm处近心端结扎，并在结扎处和颈动脉分叉之间备一根缝合线，打单结，轻轻牵拉此缝合线以暴露周围血管神经，边分离CCA，边牵拉缝合线向上滑行，直至CCA、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）和枕动脉与周围组织游离。紧靠颈动脉分又处结扎ECA和枕动脉，在ICA穿线打活结暂时阻断ICA血流。在CCA结扎处和其上端备线处之间剪一小口，用制备好的栓线沿CCA插入ICA，此时适度扎紧CCA备用的缝合线，以阻断ICA血液流出为宜，同时松开ICA的结扎线，继续沿ICA推进栓线，当感到有阻力时，停止进线，此时栓线即到达大脑中动脉起始处，扎紧CCA的缝合线，以防止其内的线栓移动和出血。最后剪除多余的栓线，分层缝合切口。注意避免损伤迷走神经。在插线的过程中要注意手感，当遇到阻力时，不要用蛮劲插入，手法要轻柔、迅速，按照动物的体重和营养选择适当的栓线。术后2 h对大鼠进行神经行为学评价。以Longa 5级4分法评价模型的有效型。术后2 h和术后7 d分别采用Garcia JH评分标准评价受试大鼠运神经功能。

1.4 大鼠外周血TNF-a、IL-6、CRP检测 造模后7 d处死大鼠，从腹主动脉采集动脉血5 mL，3500转离心30 min后取血清，-20 ℃保存备用。采用化学发光法检测血清TNF-a、IL-6，采用免疫比浊法检测血清CRP。检测仪器：西门子DPC Immulite全自动化学发光免疫分析仪和日立7180全自动生化分析仪，仪器当天相关质控在控。

1.5 统计学处理 应用SPSS 15.0统计学软件分析数据，计量资料以（±s）表示，比较采用两样本t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补阳还五汤对MCAO大鼠神经功能的影响 术后第7天，补阳还五汤低剂量组和高剂量组大鼠神经功能得到一定程度的恢复，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；同时低剂量组和高剂量组比较差异也有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 补阳还五汤对大鼠血清TNF-a、IL-6、CRP的检测结果 实验结果显示低剂量组、高剂量组的TNF-a与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组的IL-6、CRP与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；高剂量组的IL-6、CRP与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响（±s） 分

表1 补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响（±s） 分

*与假手术组比较，P＜0.05；△与模型组比较，P＜0.05；#与低剂量组比较，P＜0.05

组别术后2 h术后7 d假手术组（n=15）18.0±0.018.0±0.0模型组（n=15） 7.8±0.8*8.4±1.0*低剂量组（n=15） 8.4±0.6 10.8±1.1△高剂量组（n=15） 9.0±0.9 12.5±1.3△#

表2 补阳还五汤对大鼠血清TNF-a、IL-6、CRP的影响（±s）

表2 补阳还五汤对大鼠血清TNF-a、IL-6、CRP的影响（±s）

*与模型组组比较，P＜0.05

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3 讨论

补阳还五汤出自清代王清任著《医林改错》一书，由黄芪、赤芍、川芎、当归、地龙、桃仁、红花七药组成，针对气虚血瘀型中风后遗症而设[2]。方中重用黄芪，少佐活血化瘀之品，诸药合用，使气旺血行、瘀祛络通[3]。现代医学研究证实，补阳还五汤具有扩张血管、增加脑血流量、改善微循环、降低血液黏滞性、抗血小板聚集、抗血栓、对抗脑缺血后脑组织损伤等多种途径发挥临床作用[4-6]。

本实验结果显示，MCAO大鼠经补阳还五汤灌胃治疗后，神经损伤得到一定程度的恢复（P＜0.05），并且与药物剂量密切相关（P＜0.05）。肿瘤坏死因子TNF-a，主要由单核巨噬细胞、T淋巴细胞及脂肪细胞等分泌，是体内重要的炎症因子，具有多重生物功能，其对血管炎性反应过程的具有调节和促进生长的作用[7-8]。IL-6是白细胞和内皮细胞激活的关键，其在动脉粥样硬化血管壁中的浓度为其血清浓度的200倍，同时其可使血管平滑肌增生，促进动脉硬化进展及斑块由稳定向不稳定发展[9-10]，另外IL-6激活的白细胞可诱导大量细胞黏附，导致微血管堵塞，加重脑损伤，并与脑卒中后功能康复及脑梗死体积密切相关[11-12]。CRP是机体应激状态时合成的急性期反应蛋白，在机体对炎症、组织损伤、感染等反应中起着重要作用。CRP不仅是心血管病的独立危险因子，而且可精确、敏感地反映粥样硬化斑块炎症反应程度，与患者脑梗死面积大小及意识障碍水平相关[13-15]。

本实验中MCAO大鼠术后第7天，采集大鼠外周血，观察MCAO大鼠外周血相关炎症指标TNF-a、 IL-6、CRP。结果显示补阳还五汤（无论低剂量或高剂量）干预后，TNF-a均出现不同程度下降（P＜0.05），IL-6、CRP在高剂量组下降明显，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示补阳还五汤可下调MCAO大鼠TNF-a、IL-6、CRP水平，通过减轻炎症作用，达到神经保护的作用，从实验室的角度进一步证实了补阳还五汤的功效。然而作为一个经方，补阳还五汤的作用还未十分明了，其中对细胞凋亡的调控将是未来本课题组研究的重要方向。

致谢：实验平台，福建省康复技术工程研究中心。

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Influence of Buyanghuanwu Decoction on the Expression of TNF-ɑ，IL-6，CRP in Cerebral Ischemia Rats/

WU Xuan， WANG Xin，CHEN Yun-huan，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（12）：030-032

Objective：To discuss the influence of Buyanghuanwu decoction on the expression of TNF-ɑ，IL-6，CRP in MCAO rats.Method：60 rats were divided into four groups：control group， model group，low-dose of Buyanghuanwu decoction group and high-dose of Buyanghuanwu decoction group.Motor nerve function of rat was evaluated by using Garcia JH score ，serum TNF-ɑ，IL-6 were detected by using bioluminescence and serum CRP were detected by using immunoturbidimetry.Result：7 days after surgery，compared with model group， nerve function of rats recovered in low-dose group and high-dose group，with significant difference（P＜0.05）.There was significant difference betweenlow-dose group and high-dose group（P＜0.05）.Compared with model group，there was significant difference of TNF-ɑ in low-dose group and high-dose group（P＜0.05）.Compared with model group，there was no difference of IL-6，CRP in low-dose group（P＞0.05） ，with significant difference in high-dose group（P＜0.05） .Conclusion：In order to protect nerve function，Buyanghuanwu decoction can reduce TNF-ɑ，IL-6，CRP and relieve inflammation.

Buyanghuanwu decoction； Nerve function； Inflammation factor

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.12.009

2014-10-27） （本文编辑：蔡元元）

福建中医药大学重点学科（脑血管疾病康复的基础和临床研究）专项校管课题（X2014076-学科）；福建省中青年教师教育科研项目（科技B类）（JB14056）；福建省卫生计生委青年科研课题（2014-2-37）

①福建中医药大学附属康复医院 福建 福州 350003

汪欣

First-author’s address：Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China