脑源性神经营养因子对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的影响

赵淑杰 朱雨岚

1）北京民航总医院神经内科 北京 100025 2）哈尔滨医科大学神经内科 哈尔滨 150080

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是慢性进行性神经系统变性病，虽然目前有许多治疗药物，但都不能改善其自然病程。寻找一种能延缓或逆转病情发展的保护性治疗措施是帕金森病治疗所追求的重要目标，国内外研究表明，神经生长因子对体外培养的多巴胺能神经元的存活和分化均有一定影响，不仅可促进多巴胺能神经元的存活，还能够显著降低6-OHDA对多巴胺能神经元的毒性作用，本文就BDNF对实验动物的多巴胺能神经元的影响进行报告。

1 资料与方法

1.1 行为学观察 所有大鼠术前常规进行行为学测试，确认无异常旋转行为，生理盐水对照组术后14d，基本上无旋转行为。6-OHDA组在注射6-OHDA后24h旋转行为＞10 r／min，术后14d，旋转行为＞10r／min，6-OHDA＋BDNF组经过神经营养因子注射术后14d，旋转能力减慢，10只大鼠基本上旋转5～8r／min，术后21d，10只大鼠旋转能力仍为5～8r／min。见表1。

表1 大鼠注射术后旋转行为变化表 （时间，r／min）

1.2 大鼠黑质DA能神经元数目的变化 镜下观察TH阳性神经元，TH阳性神经元主要见于生理盐水组的黑质，数量较多，胞体较大，呈锥体型或椭圆型，神经元轴突明显，（42.3±7.56）个／μm2（见图1）。6-OHDA组大鼠黑质的TH阳性神经元数明显减少，（2.41±1.07）个／μm2；神经元胞体肿胀，轴突少，细胞轮廓不清（见图2）。2组差别具有统计学意义（P＜0.01），且神经元胞体轮廓及突起也不清晰。6-OHDA＋BDNF组神经元数为（15.36±3.04）个／μm2，神经元胞体比6-OHDA组明显好转，损伤恢复明显（见图3）。各组结果见表2，统计学处理差异明显。

1.3 纹状体多巴胺含量变化 6-OHDA对黑质纹状体的损害还体现在使纹状体多巴胺含量减少，6-OHDA＋BDNF组纹状体内多巴胺含量较6-OHDA组增高，差别具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

图1 生理盐水组黑质部TH阳性神经元（×200）

图2 6-OHDA组黑质部TH阳性神经元（×400）

图3 6OHDA＋BDNF组黑质部TH阳性神经元（×200）

表2 大鼠黑质TH神经元的变化 （个／μm2）

表3 大鼠纹状体部多巴胺含量变化 （按湿重，μg／g）

2 讨论

近年来不少研究揭示了PD的细胞凋亡证据［1-3］。将纯的NTFs培养基体外培养胚胎多巴胺能神经元，能明显提高其存活率，减少细胞凋亡［4-6］。目前国外已经开始研究神经营养因子对体内多巴胺能神经元的保护作用［7］，并把其基因同酪氨酸羟化酶基因联合起来，一方面既可促进多巴胺合成，另一方面又能保护多巴胺能细胞免受损伤，取得了一定成果。Frim等［8］将BDNF基因介入到成纤维细胞，再将成纤维细胞提前移植于1-甲基-4-苯-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）毁损纹状体的PD大鼠模型，可防止1-甲基-4苯基吡啶（MPTP）对大鼠的毒性作用，说明其具有保护黑质多巴胺能神经元的作用，这可能是通过逆轴突转运诱导细胞的保护机制或增加线立体的功能发挥作用的。在用药途径上本研究避开血脑屏障（blood brain barrier，BBB）将BDNF通过立体定向注入黑质，与David的研究比较，药物作用更直接，起效更快，而David等的方法是等移植细胞成活后，通过已经介导了BDNF基因的成纤维细胞的自分泌和旁分泌，产生BDNF发挥作用。旋转行为观察方面，本实验与David等的研究相吻合，并且旋转行为减少持续存在。且TH阳性神经元数量、纹状体多巴胺含量BDNF组比模型组也有显著增加，因其能特异性保护多巴胺能神经元免受损伤，清除致病因子，因此神经营养因子可用于PD的治疗［9］。

Rosenblad等［10］通过纹状体和侧脑室两种途径注入胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和神经营养因子（NTFs），探讨它们的神经保护作用，结果发现GDNF可提供几乎92%的保护作用。本实验也采用药物直接作用方式，将BDNF通过立体定向注射于黑质致密部，结果发现BDNF减轻6-OHDA对纹状体多巴胺含量下降（6-OHDA＋BDNF组与6-OHDA组比较减轻20%），减轻6-OHDA对多巴胺能神经元损伤（见表2）；治疗前后行为学观察对比，治疗后症状明显改善；大鼠黑质致密部TH神经元的变化说明本课题治疗组与PD模型组差别具有统计学意义；纹状体多巴胺含量观察治疗后与PD模型组差别具有统计学意义。本实验与Rosenblad等结果一致，即神经营养因子对多巴胺能神经元有显著的保护作用。我们分析BDNF主要通过以下几种途径保护多巴胺能神经元：（1）BDNF通过与受体结合使细胞内钙结合蛋白（Calbindin）及其mRNA含量增加［11］，与细胞内超载钙离子结合，并促进其排出，保持细胞内钙的稳定性，从而保护神经元免受损伤。（2）BDNF、GDNF能促进超氧化物歧化酶（SOD）及谷光甘肽过氧化物酶的生成并增强其活性，使自由基减少，从而减轻了自由基对神经元的损伤。（3）研究表明，神经元损伤与兴奋性氨基酸——谷氨酸的过量释放导致的谷氨酸兴奋性毒性有直接关系。而神经营养因子的表达，分别受谷氨酸和GABA所介导，而BDNF可抑制兴奋性递质特别是谷氨酸的释放，减少细胞损伤。（4）NTFs还可通过阻止细胞色素C的释放，从而抑制细胞凋亡的启动。因此，NTFs对PD患者多巴胺能细胞具有保护作用。

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［10］Rosenblad C，Kirik D，Devaux B，et al.Protection and regeneration of nigral dopaminergic by neurturin or GDNF in a partial lesion midel of Parkinson‘s disease after afministration into the strial or the lateral ventricle［J］.Eur J neurosci，1999，11（5）：1 554-1 556.

［11］Clarkson ED，Zawada WM，Freed CR.GDNF reduces apoptosis in dopaminergic neurons in vitro［J］.Neuroreport，1995，7（1）：145-148.