经兔耳背动脉留置针反复采血后局部血管组织炎性细胞因子表达的实验研究

王安素 ，罗培芳 ，秦成诚 ，张 莉 ，李茜茜 ，杨 平 ，汪 晨

（1.遵义医学院附属医院a.胸心血管外科；b.护理部；c.小儿内科，贵州 遵义563000；2.遵义医学院 护理学院，贵州 遵义563000）

【论 著】

经兔耳背动脉留置针反复采血后局部血管组织炎性细胞因子表达的实验研究

王安素1a，罗培芳1a，秦成诚2，张 莉1b，李茜茜2，杨 平1c，汪 晨2

（1.遵义医学院附属医院a.胸心血管外科；b.护理部；c.小儿内科，贵州 遵义563000；2.遵义医学院 护理学院，贵州 遵义563000）

目的观察经兔耳背动脉留置针不同频率采血，局部血管损伤炎性细胞因子的变化，为临床动脉留置针的科学规范使用及动脉血管的保护提供动物实验依据。方法将新西兰大白兔48只按随机数字表法随机分为对照组（n=12）、实验组A组（n=12）、实验B组（n=12）、实验C组（n=12）。对照组经兔耳背动脉留置针使用浓度为125 U/mL肝素液2 mL封管，2次/d。实验组经兔耳背动脉留置针不同频率采集血标本，实验A组共采血64次，实验B组共采血32次，实验C组共采血16次，每次采血完毕均用浓度为125 U/mL肝素液2 mL封管。96 h后，对48只大白兔于穿刺点前2 cm处取动脉血管和局部组织的标本，切片行免疫组化，检测肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-10的表达。结果肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-10在实验A组、实验B组、实验C组、对照组的表达均依次减弱，分别比较各组间肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-10表达的积分光密度值，差异有统计学意义（P均<0.05）。结论兔耳背动脉留置针保留96 h，经留置针处采血频率越高致肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-10表达越明显，说明动脉血管损伤炎症反应越严重。

留置针；动脉血管；炎性细胞因子

经外周动脉留置针采集血标本及进行持续有创血压监测是临床医疗救治急危重症患者的重要手段[1]。经动脉留置针处采集血标本、有创血压监测能有效减少及避免相关并发症的发生[2]，现已被广泛应用于临床急救领域、心血管外科、重症监护病房、手术麻醉中[3-4]。临床工作中发现动脉留置针的长期留置及护理不当亦会导致局部血管内膜受损，发生萎缩甚至坏死，引发动脉炎症反应的发生。如何做好动脉血管保护，减轻患者的痛苦已成为护理亟待解决的问题。本研究建立兔耳背动脉血管损伤模型，观察经动脉留置针处不同频率采血致局部动脉血管及周围组织中炎性细胞因子的改变，为留置针致动脉血管损伤早期防护提供动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由重庆市中药研究院实验研究所提供普通级成年健康新西兰大白兔48只[生产许可证号 SCXK（渝）2012-0006]，雌雄不限，体质量（2.5±0.5）kg。大白兔均进行适应性喂养2周。饲养条件：室温15～25℃，相对湿度 40%～70%，自由饮水，分笼饲养。饮食活动正常者于实验前2 d剪去耳背毛发,使用8%硫化钠脱毛，用清水擦净耳背，暴露耳背动脉，确定耳背局部皮肤及血管完好无破损。将实验动物称重并按照体质量从轻到重编号，采用随机数字表法将其分为对照组（n=12），实验 A 组（n=12），实验B 组（n=12），实验 C 组（n=12），各组雌雄和体质量比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。

1.2 实验材料 选取Vialon材料制成BD安全留置针（美国BD公司生产,规格：0.7 mm×19 mm,24 G）、3L透明敷贴 （江西3L医用制品集团股份有限公司）；昆明绿盟科技有限公司生产：戊巴比妥钠、硫化钠；北京Biosynthesis生物公司生产：肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）抗体、白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β） 抗体、 白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）抗体北京中杉金桥生物技术有限公司生产兔二步法检测试剂盒；细胞图像分析系统（德国徕卡公司生产，型号：LEICA QWIN）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的建立 实验大白兔用戊巴比妥钠行腹腔麻醉,剂量为30 mg/kg，麻醉生效、呼吸平稳后用固定箱固定,取耳背动脉距耳尖2～3 cm处为穿刺点,并用甲紫溶液标记。大白兔均选择右耳背动脉进行留置针穿刺,留置针保留96 h,并经留置针处予不同频率采集血标本,从而导致留置针对局部动脉血管产生机械刺激性损伤,建立留置针致动脉血管损伤的模型（本实验已通过遵义医学院实验动物伦理委员会伦理审批）。

1.3.2 操作方法 （1）对照组，经兔右耳背动脉进行留置针穿刺，但不经动脉留置针处采血，每天8：00、17：30用浓度为125 U/mL的肝素稀释液 2 mL封管。（2）实验组经兔右耳背动脉进行留置针穿刺，并经留置针处不同频率采集血标本刺激动脉血管，实验组均于每天 8：00～11：30 和 14：00～17：30 采血。 实验A组每间隔30 min采血1次，连续4 d，共采血64次；实验B组每间隔60 min采血1次，连续4 d，共采血32次；实验C组每间隔120 min采血1次，连续4 d，共采血16次。本实验所有操作均模拟临床，操作环境清洁，操作前用三氧消毒机消毒2 h，开窗通风0.5 h，各项操作严格遵循无菌操作原则及消毒隔离制度。每次采血之前均用5 mL注射器先抽取1 mL动脉血，再用1 mL注射器采血0.1 mL，每次采血完毕均用浓度为125 U/mL肝素液2 mL封管，所有操作由本研究者进行，并保证48只大白兔每次采血均1次穿刺成功。

1.3.3 标本制作 96 h后大白兔均行腹腔给药麻醉，以兔耳背动脉穿刺点前2 cm为中心，取2cm×2 cm含动脉血管和局部组织的标本，切片行免疫组化[5]，检测肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-10的表达，计算积分光密度值。

l.3.4 统计学方法 使用专业图像分析ipp 6.0计算积分光密度值，采用 SPSS 18.0进行数据录入和分析，多组间比较采用方差分析，用SNK法进行两两比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组肿瘤坏死因子-α表达情况的比较 肿瘤坏死因子-α表达在实验A组、实验B组、实验C组、对照组中依次减少,各组肿瘤坏死因子-α表达的积分光密度值比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,见表 1。肿瘤坏死因子-α免疫组化染色,着色于炎性细胞、内皮细胞胞浆中，呈浅棕黄色、棕黄色或褐色颗粒。见图1—图4。

表1 各组实验兔耳血管及周围组织中肿瘤坏死因子-α表达情况的比较（±S，×103）

表1 各组实验兔耳血管及周围组织中肿瘤坏死因子-α表达情况的比较（±S，×103）

注：*表示P＜0.05，与实验组A组比较；△表示P＜0.05，与实验组B组比较；#表示P＜0.05，与对照组比较

组别 n 肿瘤坏死因子-α表达实验A组 12 13.387±0.596#实验B组 12 8.487±0.407*#实验 C 组 12 3.775±0.254*△#对照组 12 0.423±0.045 F 3252.707 P 0.000

图1 实验A组血管及周围组织中肿瘤坏死因子-α的表达（x100）

图2 实验B组血管及周围组织中肿瘤坏死因子-α的表达（x100）

图3 实验C组血管及周围组织中肿瘤坏死因子-α的表达(x100)

图4 对照组血管及周围组织中肿瘤坏死因子-α的表达（x100）

2.2 各组白细胞介素-1β表达情况的比较 白细胞介素-1β表达在实验A组、实验B组、实验C组、对照组中依次减少，各组白细胞介素-1β表达的积分光密度值比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。白细胞介素-1β表达免疫组化染色,均着色于炎性细胞及内皮细胞胞质和细胞膜，阳性细胞胞质和胞膜可见棕黄色颗粒，见图5-图8。

表2 各组实验兔耳血管及周围组织中白细胞介素-1β表达情况的比较（±S，×103）

表2 各组实验兔耳血管及周围组织中白细胞介素-1β表达情况的比较（±S，×103）

注：*表示P<0.05，与实验组A组比较；△表示P<0.05，与实验组B组比较；#表示P<0.05，与对照组比较

组别 n 白细胞介素-1β表达实验 A 组 12 9.016±0.428#实验 B 组 12 7.084±0.404*#实验 C 组 12 2.713±0.260*△#对照组 12 0.393±0.043 F 1956.251 P 0.000

图5 实验A组 血管及周围组织中白细胞介素-1β的表达（x100）

图6 实验B组 血管及周围组织中白细胞介素-1β的表达（x100）

图7 实验C组 血管及周围组织中白细胞介素-1β的表达（x100）

图8 对照组 血管及周围组织中白细胞介素-1β的表达（x100）

2.3 各组白细胞介素-10表达情况的比较 白细胞介素-10表达在实验A组、实验B组、实验C组、对照组中依次减少，各组白细胞介素-10表达的积分光密度值比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。白细胞介素-10免疫组化染色，均着色于浸润的炎性细胞、内皮细胞胞浆、胞膜，呈棕黄色染色。见图9—图12。

表3 各组实验兔耳血管及周围组织中白细胞介素-10表达情况的比较（±S，×103）

表3 各组实验兔耳血管及周围组织中白细胞介素-10表达情况的比较（±S，×103）

注：*表示P<0.05，与实验组A组比较；△表示P<0.05，与实验组B组比较；#表示P<0.05，与对照组比较

组别 n 白细胞介素-10表达实验 A 组 12 7．456±0.357#实验 B 组 12 5．573±0.350*#实验 C 组 12 2.770±0.249*△#对照组 12 0.437±0.040 F 2297.238 P 0.000

图9 实验A组 血管及周围组织中白细胞介素-10的表达（x100）

图10 实验B组 血管及周围组织中白细胞介素-10的表达（x100）

图11 实验C组 血管及周围组织中白细胞介素-10的表达（x100）

图12 对照组 血管及周围组织中白细胞介素-10的表达（x100）

3 讨论

3.1 经兔耳背动脉留置针采血频率越高，其耳背血管及周围组织中促炎因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β表达越明显 动脉留置针对血管是一种机械刺激损伤，可直接损伤血管内皮细胞，通过留置针采血会对血流形成涡流与湍流，亦会损伤血管内皮细胞。内皮细胞受损使血管的通透性增加，炎性细胞在趋化因子的作用下渗出血管壁致炎性组织引起急性炎症，炎性反应的重要标志是白细胞浸润，在炎症早期，主要以中性粒细胞浸润为主[6]。大量研究证实，中性粒细胞可释放肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、干扰素-γ等，在出血和炎症的刺激下，血管内皮细胞可大量表达白细胞介素-1β。文献报道[7]白细胞介素-1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子是介导急性期炎症反应重要细胞因子。肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β作为急性期重要的炎症介质在创伤、炎症等病理情况下表现为增加,尤其在炎症反应中的表现尤为明显。结果显示，肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β在血管周围组织及血管内皮细胞中出现高表达，提示留置针致动脉血管发生急性炎症反应，血管周围出现炎性细胞浸润，血管内皮受到炎症刺激。肿瘤坏死因子-α损伤血管内皮细胞，引起血管功能紊乱，促使血管损伤及血栓形成；白细胞介素-1β是机体内非常活跃的促炎细胞因子之一，可诱导刺激机体内皮细胞和白细胞释放一系列相关炎性介质，从而引导局部组织或全身的炎症反应[6]。白细胞介素-1β的主要功能与作用包括2方面[8]，一方面当白细胞介素-1β在局部表达浓度比较低时，主要对机体起免疫调节作用；另一方面当其在病变局部表达浓度高时，则引起机体的炎症反应。结果显示，肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的表达水平在实验 A组、实验B组、实验C组、对照组依次减弱，各组比较均有统计学意义（P＜0.05）。提示采血频率最高实验A组，炎性细胞浸润最明显，释放肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β最多。肿瘤坏死因子-α越多对血管内皮细胞损伤越重，导致白细胞介素-1β表达相对较高。提示经动脉留置针采血频率较高，留置针对动脉血管直接发生机械损伤较重，采血对血流形成涡流与湍流损伤血管内皮细胞较重，通透性较高，急性炎症反应较严重。本研究结果与张迅等[9]报道肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的表达水平同血管损伤程度呈正相关结果一致。

3.2 经兔耳背动脉留置针采血频率越高，其耳背血管及周围组织中抗炎因子白细胞介素-10表达越明显 炎症是损伤、抗损伤和修复的统一过程，促炎性反应和抗炎性反应同时存在[6]。白细胞介素-10被认为是体内最重要的抗炎细胞因子，几乎可以抑制所有的促炎性细胞因子的合成与释放，对下调炎性反应发挥重要作用。并且能抑制巨噬细胞活化，防止巨噬细胞过度活化对宿主组织产生损伤。白细胞介素-10能从以下几个方面发挥对血管内皮的保护作用：抑制肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6等炎症细胞因子[10-11]；抑制单核细胞贴壁、黏附分子及趋化因子的产生和功能的发挥；抑制外周血中单核细胞组织因子的表达及活性，从而限制促凝活性。白细胞介素-10的抗炎作用在大量的机体内外及动物实验中均得到证实，在鼠及灵长类动物的内毒素攻击模型[12]、缺血再灌注及烧伤动物模型中，白细胞介素-10均有保护作用，通过减弱促炎细胞因子的反应，降低了病死率。本研究结果显示，白细胞介素-10的表达水平在实验A组、实验B组、实验C组、对照组中依次减弱，各组差异比较均有统计学意义（P＜0.05），提示随采血频率增加，机体局部产生白细胞介素-10对抗炎性反应增强。在炎症反应过程中，促炎因子与抗炎因子相互作用、相互抑制，并持续存在。本实验研究发现，随采血频率增加机体局部产生促炎因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β水平升高，抗炎因子白细胞介素-10也明显上升，肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β表达并没有随白细胞介素-10抗炎因子增加而减少，甚至促炎因子的上升水平更明显。究其原因，动脉留置针机械刺激损伤因子持续存在，并且采血频率越高，刺激损伤越大，机体炎性反应越严重。肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β表达未能得到有效抑制，引起促炎和抗炎失衡；也可能与动物实验研究时间较短,白细胞介素-10的合成晚于促炎性细胞因子有关。

4 小结

经兔耳背动脉留置针保留96 h并经留置针处采血频率最高的实验A组，肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-10的表达相对明显，表明实验A组动脉血管损伤炎症反应最重。提示在临床工作中对动脉留置针处频繁采集血标本的患者，为避免反复采血刺激动脉血管导致局部血管炎症反应，应适当减少采血频率，缩短动脉留置针留置时间，具体的留置时间还有待进一步研究。本实验研究未对肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-10的表达随时间的变化进行监测，有待进一步研究。

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Changes of Inflammatory Cytokines in Indwelling Needle-induced Local Arterial Injury

WANG An-shu1a,LUO Pei-fang1a,QIN Cheng-cheng2,ZHANG Li1b,LI Xi-xi2,YANG Ping1c,WANG Cheng2
(1a.Dept.of Cardiovascular Thoracic Surgery;1b.Dept.of Nursing Adminstration;1c.Dept.of Pediatric Internal Medicine,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China;2.School of Nursing,Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China)

ObjectiveTo observe the change of inflammatory cytokines in local arterial injury induced by different frequencies of blood sampling and to provide reference for the standardized usage of arterial indwelling needle and the protection of artery.MethodsForty-eight New Zealand white rabbits were randomly divided into control group,experiment group A,experiment group B and experiment group C,with 12 in each group.Different times of blood sampling were performed in experiment groups while in control group,arterial indwelling needles were locked by 2 mL heparin solution with a concentration of 125 U/mL,with 2 times per day. Artery and local tissue 2 cm in radius for puncture point after 96 h were taken for immunohistochemistry to determine the expression of tumor necrosis factor α, interleukin1β and interleukin10.ResultsThe expression of tumor necrosis factor α,interleukin1β and interleukin10 reduced in experiment group A,experiment group B and experiment group C and control group in sequence.The difference of integrated optical density of the expression of tumor necrosis factor α;interleukin1β and interleukin10 in each group indicated statistical significance (all P<0.05).ConclusionThe significant expression of tumor necrosis factor α,interleukin1β and interleukin10 in arterial indwelling indicates serious inflammatory reaction in local arterial injury when arterial indwelling needle remains 96 hours.

indwelling needle;artery;inflammatory cytokines

R-332

A

10.16460/j.issn1008-9969.2015.03.001

2014-09-29

贵州省科学技术基金项目（2013-2330）

王安素（1982-），女，贵州遵义人，硕士研究生，主管护师。

张 莉（1964-），女，贵州遵义人，本科学历，教授，护理部副主任。

方玉桂 谢文鸿]