黄芪和三七有效成分对脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响

·论著·

黄芪和三七有效成分对脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响

欧阳翌国1,丁煌2,邓常清2,唐映红2,黄小平2*(

1.湖南中医药高等专科学校,湖南 株洲412012；2.湖南中医药大学,湖南 长沙410208)

摘要：目的从细胞凋亡角度探讨黄芪和三七有效成分配伍抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法将C57BL/6小鼠随机分为：假手术组、模型组、黄芪甲苷(AST Ⅳ)组、人参皂苷Rg1(Rg1)组、人参皂苷Rb1(Rb1)组、三七皂苷R1(R1)组、四种有效成分配伍组、AST Ⅳ+ Rg1组、AST Ⅳ+ Rb1组、AST Ⅳ+R1组、阳性对照药依达拉奉组，给药3 d后，夹闭双侧颈总动脉造成脑缺血再灌注模型，再灌注24 h后，TUNEL法检测神经细胞凋亡，计算凋亡率，western-blot法测定脑组织caspase-3蛋白表达。结果缺血再灌注后神经细胞凋亡率升高，caspase-3表达上调，各给药组均能降低神经细胞的凋亡率和caspase-3的表达。AST Ⅳ+ Rg1与AST Ⅳ+R1降低凋亡率和caspase-3表达的效应分别大于各药物单用。四种有效成分配伍组降低凋亡率的效应大于四种有效成分单用及AST Ⅳ+ Rb1，抑制caspase-3蛋白表达的效应大于各有效成分单用及AST Ⅳ+ Rb1、ASTⅣ+ R1。结论黄芪甲苷与三七的主要有效成分配伍能增强对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的抑制作用，AST Ⅳ+ Rg1、AST Ⅳ+R1以及四种有效成分配伍对细胞凋亡的抑制作用增强。

关键词：黄芪甲苷；三七的有效成分；脑缺血再灌注；细胞凋亡

文章编号：1673-2995(2015)06-0437-04

中图分类号：R285.5

作者简介：欧阳翌国(1979-)，男(汉族)，讲师,硕士.

收稿日期：(2015-05-18)

Effects of Astragaloside IV combined with active components of Panax notoginseng on apoptosis in brain tissues after cerebral ischemia-reperfusion in mice

OUYANG Yiguo1,DING Huang2,DENG Changqing2,TANG Yinghong2,HUANG Xiaoping2*(1.Hunan Traditional Chinese Medical College,Zhuzhou,Hunan Province,412012;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan Province,410208,China)

通讯作者：黄小平(1976-)，女(汉族)， 副教师，硕士.

Abstract:ObjectiveTo explore the mechanism of combination of Astragaloside IV and Panax notoginseng active ingredient against cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into:sham,model,Astragaloside Ⅳ (AST Ⅳ),Ginsenoside Rg1 (Rg1),Ginsenoside Rb1 (Rb1),Notoginsenoside R1 (R1),four active components combination,AST Ⅳ+ Rg1,AST Ⅳ+ Rb1,AST Ⅳ+ R1 and Edaravone,pretreated for 3 d.After 1 h of the last administration,the model of cerebral ischemic-reperfusion injury was established by bilateral common carotid artery (CCA) ligation followed by reperfusion,then TUNEL method was used to detect apoptosis and apoptosis rate was calculated,expressions of caspase-3 proteins in brain tissues were tested by western-blot at 24 h after reperfusion. ResultsAfter cerebral ischemia-reperfusion,the apoptosis rate of nerve cell and the expression of caspase-3 protein in brain tissues were increased. All drugs could decrease the apoptosis rate,inhibit caspase-3 protein expression. Furthermore,the decreased effects of AST Ⅳ+ Rg1 and AST Ⅳ+ R1 on the apoptosis rate and caspase-3 protein expression were better than those of the active components alone;In four active components combination,the decrease of the apoptosis rate was stronger than that of four active components alone and AST Ⅳ+ Rb1,the inhibition of caspase-3 was greater than that of four active components alone and AST Ⅳ+ Rb1,AST Ⅳ+ R1. ConclusionAST Ⅳ combined with the effective components of Panax notoginseng had the potentiation on the inhibition of apoptosis.The inhibitory effect of AST Ⅳ+ Rg1,AST Ⅳ+R1 and four kinds of active ingredient combination on cell apoptosis are enhanced.

Key words：stragaloside IV;active components of Panax notoginseng;cerebral ischemia-reperfusion;apoptosis

脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIR)是指缺血脑组织在恢复血液灌注后，脑组织损伤进一步加重的现象[1]。脑缺血后神经细胞的损伤形式可分为急性损伤和迟发性损伤，而细胞凋亡是导致迟发性损伤的主要病理机制。细胞凋亡是细胞在相关基因的控制下进行的自主的程序化的死亡过程。在凋亡过程中，半氨天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，caspase)，起到重要的调控作用[2]。caspase-3是caspase家族中重要成员之一，是细胞凋亡过程中最主要的终末效应部分，是细胞凋亡的必经之路[3-4]，故caspase-3表达上调可作为细胞凋亡的标志。

依达拉奉是一种脑保护剂，其主要作用是清除自由基，抑制脂质过氧化，保护脑、血管内皮和神经细胞避免氧化损伤，临床上主要用于治疗脑梗死，具有确切的临床疗效。近年来有研究表明[5]，依达拉奉可明显减少急性脑缺血再灌注大鼠脑神经细胞凋亡数，故选择其作为本研究的阳性对照药。

1　材料与方法

1.1　实验药物与试剂

三七皂苷R1对照品(批号：12051001，规格：20 mg/支)、黄芪甲苷对照品(批号：12061101，规格：20 mg/支)、人参皂苷Rb1对照品(批号：12051001，规格：20 mg/支)、人参皂苷Rg1对照品(批号：12052401，规格：20 mg/支)，以上药品均由成都曼思特生物科技有限公司提供。依达拉奉(批号：80-090711，规格：10 mg/支)，由南京先声东元制药有限公司提供，给药时用0.9%氯化钠稀释，配成0.4 mg/mL溶液。

蛋白质抽提试剂盒(产品货号：KeyGEN，由南京凯基生物科技发展有限公司提供)、BCA蛋白质定量试剂盒(产品货号：AR0146，由武汉博士德生物工程有限公司提供提供)、细胞凋亡检测试剂盒Ⅲ(FITC)(产品货号：MK1023，由武汉博士德生物工程有限公司提供)、磷酸酶抑制剂复合物Ⅲ(产品货号：C500019-0001,由上海生工生物工程股份有限公司提供)；兔抗小鼠Caspase-3抗体(批号：SC7148，购自Santa Gruz Biotechnology)，兔抗小鼠β-actin抗体(批号：sc-130656，购自Santa Gruz Biotechnology)，均4℃保存；HRP-Goat Anti-Rabbit Ig(H+L)(批号：SA00001-2，购自Proteintech Group)，-20 ℃保存。

1.2　动物、分组及给药方法

88只SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体重20～25g。饲养于SPF级动物实验室，相对湿度40%～60%、温度20～26 ℃。根据前期实验结果[9]，随机分为以下11组：1.假手术组，2.模型组，3.黄芪甲苷组，4.Rg1组，5.Rb1组，6.R1组，7.四种有效成分配伍组，8.黄芪甲苷+Rg1组，9.黄芪甲苷+Rb1组，10.黄芪甲苷+R1组，11.阳性对照药依达拉奉组。各组给药剂量:1、2组0.5%甲基纤维素钠10 mL/kg;3组AST Ⅳ40 mg/kg;4组Rg1 50 mg/kg;5组Rb1 40 mg/kg;6组R1 10 mg/kg;7组AST Ⅳ和Rb1各40 mg/kg,Rg1 50 mg/kg,R1 10 mg/kg;8组AST 40 mg/kg,Rg1 50 mg/kg;9组AST Ⅳ和Rb1各40 mg/kg;10组AST 40 mg/kg,R1 10 mg/kg;11组依达拉奉4 mg/kg。第1-10组均灌胃给药，1次/d；第11组腹腔注射给药，2次/d。连续给药3 d，末次给药1 h后进行造模。

1.3　脑缺血模型制作

乙醚麻醉小鼠，仰卧位固定，颈部手术，用动脉夹夹闭颈总动脉20 min，造成脑缺血。假手术组也进行颈部手术，但不夹闭双侧颈总动脉。再灌注24 h后，将小鼠迅速断头，取出脑组织做相应指标检测[10]。

1.4　神经元凋亡检测

取视交叉后脑组织，固定、脱水、石蜡包埋，作冠状切片，厚度约为7 μm，TUNEL法测定神经细胞凋亡，计算凋亡率(%)。

1.5　caspase-3蛋白表达检测

取视交叉前脑组织，裂解、离心。采用BCA法进行蛋白质定量，并计算含110μg蛋白的裂解液容积作为上样量。western-blot法检测caspase-3蛋白和内参照蛋白β-actin的表达。用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定caspase-3和内参蛋白(β-actin)的累积光密度值(IOD)，并以两者IOD的比值作为caspase-3的相对表达量[11]。

1.6　统计分析方法

实验数据采运用SPSS16.0统计软件进行统计分析。各组均数采用单因素方差分析，方差齐者用最小显著性差异法检验。P<0.05为有统计学意义。

2　结　果

2.1　各组神经元凋亡率

各组神经元凋亡率的比较见图1。与假手术组比较，模型组凋亡率显著升高(P<0.01)。与模型组比较，各给药组凋亡率显著降低(均P<0.01)。AST Ⅳ+Rg1组与AST Ⅳ+R1组降低凋亡率的效应分别大于各有效成分单用组(均P<0.01)。四种有效成分配伍组降低凋亡率的效应大于四种有效成分单用组及AST Ⅳ+Rb1组(均P<0.01)，与阳性对照药依达拉奉组、AST Ⅳ+R1组、AST Ⅳ+Rg1组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

与假手术组比较：◇◇P<0.01;与模型组比较：△△P<0.01;与AST Ⅳ组比较：**P<0.01;与Rg1组比较：□□P<0.01;与Rb1组比较：■■P<0.01;与R1组比较：☆☆P<0.01;与四种有效成分配伍组比较：▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.2　各组脑组织caspase-3蛋白表达

各组脑组织caspase-3蛋白表达的比较见图2。

与假手术组比较：◇P<0.05,◇◇P<0.01;与模型组比较：△P<0.05,△△P<0.01;与AST Ⅳ组比较：*P<0.05,**P<0.01;与Rg1组比较：□P<0.05,□□P<0.01;与Rb1组比较：■P<0.05,■■P<0.01;与R1组比较：☆P<0.05,☆☆P<0.01;与四种有效成分配伍组比较：▲P<0.05,▲▲P<0.01

a.caspase-3蛋白表达的western-bloting图谱;b.caspase-3蛋白表达的比较

与假手术组比较，模型组caspase-3表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较，各给药组caspase-3表达显著下降(均P<0.01)。AST Ⅳ+Rg1组与AST Ⅳ+R1组降低caspase-3表达的效应分别大于各有效成分单用组(P<0.01或P<0.05)。四种有效成分配伍组降低caspase-3表达的效应大于各有效成分单用组、AST Ⅳ+R1组及AST Ⅳ+Rb1组(P<0.01或P<0.05)，与阳性对照药依达拉奉组、AST Ⅳ+Rg1组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

3　讨　论

本研究结果显示，对小鼠进行脑缺血再灌注处理后，其脑组织发生细胞凋亡，caspase-3蛋白表达增加。黄芪与三七的各种有效成分单用及配伍均可减轻缺血再灌注后神经细胞的凋亡，降低凋亡率，减少caspase-3蛋白的表达。AST Ⅳ+Rg1与AST Ⅳ+R1降低凋亡率和减少caspase-3蛋白表达的效应分别大于各药物单用，表明黄芪甲苷与人参皂苷Rg1或三七皂苷R1配伍对神经细胞凋亡的抑制作用增强，可能具有协同增效作用。四种有效成分配伍降低凋亡率的效应大于四种有效成分单用及AST Ⅳ+Rb1，减少caspase-3蛋白表达的效应大于四种有效成分单用及AST Ⅳ+Rb1和AST Ⅳ+R1，表明四种有效成分配伍能增强抗细胞凋亡的效应。以上分析结果提示黄芪甲苷与三七的有效成分可以抑制脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的发生，黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍、黄芪甲苷与三七皂R1配伍以及四种有效成分配伍对细胞凋亡的抑制作用增强。

参考文献：

[1]张春霞，胡利民，康立源，等.脑缺血氧化应激损伤及中药拮抗作用研究进展[J].中华中医药学刊，2007，25(12):2509-2511.

[3]张鸿,宋利春,刘艳艳,等.Pinacidil抑制线粒体和死亡受体通路减少大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡[J].神经科学通报:英文版,2007,23(3):145-150.

[4]Oida Y,Shimazawa M,Imaizumi K,et al.Involvement of endoplasmic reticulum stress in the neuronal death induced by transient forebrain ischemia in gerbil [J].Neurosci,2008,151(1):111-119.

[5]唐宝苍，马建国，毕向锋，等.依达拉奉对糖尿病脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡及缺氧诱导因子表达的影响[J].中风与神经疾病杂志，2010，27(6):521-523.

[6]黄小平,刘晓丹，邓常清.黄芪和三七主要有效成分配伍对氧化损伤所致的PC12细胞凋亡及其活性氧、线粒体膜电位的影响[J].中西医结合学报,2012,10(10):1127-1134.

[7]周军，刘军.黄芪甲甙对大鼠局灶性脑缺血的保护作用及机制研究[J].医学临床研究，2008,25(5)：814-816.

[8]唐映红，黄小平，谭华，等.三七总皂苷对脑缺血再灌注后神经元凋亡及凋亡线粒体途径和c-Jun氨基末端激酶表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010,16(16)：129-132.

[9]黄小平,王蓓,邱咏园,等.黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1抗小鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤和促进能量代谢的配伍研究[J].湖南中医药大学学报,2014,34(7):5-11.

[10]李方成，陶宗玉，刘安民，等.葡萄糖转运体3在脑缺血/再灌注后半影区表达的变化及意义[J].中国病理生理杂志，2004，20(12):2276-2279.

[11]胡国梁，何昆仑，范利.内质网应激诱导的细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤[J].中华保健医学杂志，2010，12(1):72-74.

本刊入网声明

为了实现期刊编辑、出版工作的网络化，我刊现已加入中国学术期刊(光盘版)、万方数据网等，所以，向本刊投稿并录用的稿件文章，将一律由编辑部统一纳入以上网络，进入因特网提供信息服务。凡有不同意者，请另投他刊或特别声明需另作处理。

《吉林医药学院学报》编辑部