松针层孔菌碱溶性多糖对单核巨噬细胞活性氧和增殖的影响

·论著·

松针层孔菌碱溶性多糖对单核巨噬细胞活性氧和增殖的影响

孙艳美1，藏玉玲2，杨雪2，李

1*(

吉林医药学院:1.检验学院，2.药学院,吉林 吉林132013)

摘要：目的研究松针层孔菌碱性多糖对单核细胞活性氧、凋亡和增殖的影响。方法自干燥松针层孔菌分离中等分子量松针层孔菌碱溶性多糖(MASPP)。体外培养单核系THP-1，采用不同浓度的MASPP(0、50、100、200 mg/L)诱导细胞24 h，流式细胞术检测活性氧和凋亡。不同浓度MASPP处理细胞72 h，WST-1还原法检测细胞增殖。结果诱导24 h，MASPP以浓度依赖方式导致细胞内活性氧减少。对照组和200 mg/L MASPP组凋亡细胞百分率分别为4.32%和12.37%。MASPP处理72 h对细胞增殖有抑制作用，200 mg/L MASPP组的细胞增殖抑制率为(34.3±3.8)%。结论MASPP可降低单核细胞活性氧、抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。

关键词：松针层孔菌；多糖；单核细胞；活性氧

文章编号：1673-2995(2015)06-0407-03

中图分类号：R285.5

基金项目：吉林省科技厅中青年科技创新领军人才及团队项目(20130521018JH)；吉林省卫生厅项目(2012Z076)；吉林省中医药管理局重点项目(2014ZD30).

作者简介：孙艳美(1978-)，女(汉族)，讲师，硕士.

作者简介：李(1972-)，女(汉族)，教授，博士.

收稿日期：(2015-08-06)

ROS，apoptosis and proliferation of monocyte affected by alkai-soluble Phellinus polysaccharide

SUN Yanmei1,ZANG Yuling2,YANG Xue2,LI Yan1*(1.Academy of Laboratory,2.School of Pharmacy,Jilin Medical University,Jilin City，Jilin Province,132013,China)

Abstract:ObjectiveTo study reactive oxygen species (ROS),apoptosis and proliferation of monocyte affected by alkai-soluble Phellinus polysaccharide. MethodsMiddle molecular weight alkai-soluble Phellinus polysaccharide(MASPP) was obtained from dried sporocarp of Phellinus pini.Monocyte THP-1 cells were cultured with different concentration of MASPP (0 mg/L,50 mg/L,100 mg/L and 200 mg/L) for 24 hours.ROS and cell apoptosis were detected by flow cytometry.Cell proliferation was measured by WST-1 reduction assay after cells were treated by MASPP for 72 hours. ResultsMASPP reduced intracellulor ROS dose-dependently.The percentage of apoptosis cells of control group and 200 mg/L MASPP treated for 24 hours were 4.32% and 12.37% respectively.The cells proliferation could be inhibited by MASPP for 72 hours,and the inhibition rate of 200 mg/L MASPP was (34.3±3.8)%. ConclusionMASPP could reduce ROS,induce apoptosis and inhibit cell proliferation in monocytes.

Key words:Phellinuspini;polysaccharide;monocyte;ROS

松针层孔菌(Phellinuspini)又名松白腐菌，隶属于担子菌门、伞菌纲，锈革孔菌目，锈革孔菌科，针层孔菌属。含有多糖、酚类、萜类和多类活性物质，具有免疫调节、抗氧化、抗病毒和抗纤维化等功效[1]。其子实体富含多糖，其多糖与其生物活性的关系引起重视，本研究分离松针层孔菌碱溶性多糖，并以人单

核细胞系为模型，分析其对细胞活性氧、凋亡和增殖的影响。

1　材料与方法

1.1　材　料

1640培养液购自Gibco公司；小牛血清购自Hyclone公司。双染凋亡检测试剂盒购自南京基凯生物技术有限公司。活性氧(reactive oxygen specie，ROS)荧光探针双氯荧光黄乙酸乙(Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)购自上海碧云天生物技术研究所。参考文献方法，自干燥的松针层孔菌子实体中提取粗制的松针层孔菌碱溶性多糖[2]。采用超滤离心法分离中等分子量松针层孔菌碱溶性多糖(middle molecular weight alkai-soluble Phellinus polysaccharide，MASPP)。用1640细胞培养液溶解，过滤除菌后制备为2 g/L的MASPP储存液，分装后-20 ℃保存。

1.2　细胞培养

实验前1周，复苏人单核细胞THP-1，在含10%胎牛血清的1640培养液中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3　细胞活性氧检测

接种THP-1于6孔细胞培养板，加入MASPP至终浓度为0、50、100、200 mg/L，继续培养24 h后，收集细胞。取5×105个细胞，PBS洗涤2次，100 μL PBS重悬细胞，加入DCFH-DA储存液，至其终浓度为5 μmol/L，混匀后在37 ℃避光反应30 min，PBS洗2次，400 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪分析。

1.4　细胞凋亡分析

收集MASPP(0、200 mg/L)处理24 h的THP-1细胞，每组取1×106个细胞，凋亡缓冲液洗涤1次，200 μL缓冲液悬起细胞，加入5 μL的Annexin-V FITC，室温避光孵育30 min。缓冲液洗涤细胞2次，400 μL的缓冲液重悬细胞，加入5 μL PI染液后用流式细胞仪分析。

1.5　细胞增殖分析

接种THP-1细胞于96孔细胞培养板，加入MPBPS至终浓度为0、50、100、200 mg/L。培养至68 h，对照组和实验组每孔加入WST-1溶液20 μL，空白组加入20 μL PBS，继续培养至72 h。用多功能酶联检测分析仪检测各孔450 nm的吸光度值(A450)，并按如下公式计算细胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)。取3次实验的均值代表最终浓度。

IR(%)=[1-(实验组A450-空白组A450)/(对照组A450-空白组A450)]×100

2　结　果

2.1　MASPP对人单核巨噬细胞活性氧的影响

2.2　AMASPP对THP-1细胞凋亡的影响

采用200 mg/L的MASPP处理细胞24 h，与对照组比较，MASPP处理后早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞百分率均增加。对照组(图1-A)和200 mg/L(图1-B)的MASPP组凋亡细胞(早期凋亡和晚期凋亡)百分率分别为4.32%和12.37%。

图 1　MASPP对THP-1细胞凋亡的影响

2.3　MASPP对THP-1细胞增殖的影响

MASPP处理THP-1细胞72 h后，对细胞增殖的影响见图2，当浓度达到200 mg/L，该多糖对细胞增殖具有明显的抑制作用，细胞增殖抑制率为(34.3±3.8)%。

图 2　MASPP对THP-1细胞增殖的影响

3　讨　论

参考文献：

[1]李聪，邱丽丽，张永清.针层孔菌属真菌生物活性研究进展[J].中华中医药学刊，2009，27(7)：1484-1487.

[2]于广利,王莹,赵峡,等.一种碱溶性灰树花菌丝体多糖GFM2A的制备和结构表征[J].高等学校化学学报，2007，28(1)：87-91.

[3]王晓玲，杨海龙，刘高强，等.食药用菌β-葡聚糖的结构、构效关系及其药理作用.食用菌学报，2014，21(1)：35-41.

[4]刘高强，王晓玲.灵芝多糖的抗癌构效关系及其抗癌作用机制[J].菌物学报，2006，25(3)：430-438.

[5]吴琼，郑成，宁正祥，等.碱溶性银耳粗多糖的提取及其清除自由基作用的研究[J].食品科学,2007，28(6)：153-155.