电泳与质谱技术联用鉴定牛乳酪蛋白分子酶法脱磷酸化修饰*

王园园，程英华，刘大松，胡锦华，周鹏

(江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

牛乳蛋白具有良好的营养和功能特性，被广泛地应用于婴幼儿乳粉配方中［1-2］。然而人乳和牛乳在组成、含量和功能性等方面有显著差异［3］。在模拟人体外胃肠液中，人乳酪蛋白变成疏松的絮凝状，比牛乳形成的凝块更容易消化吸收［4］。人乳中乳清蛋白和酪蛋白比例为6∶4，其中酪蛋白的主要成分是β-酪蛋白［5］。牛乳中酪蛋白占总蛋白含量的80%左右，分别是 αs1-，αs2-，β-和 κ-酪蛋白，比例约为38%，10%，36%和12%［2］。酪蛋白具有独特的一级和三级结构，转录翻译后在部分丝氨酸残基上产生了磷酸化共价修饰。与牛乳β-酪蛋白的完全磷酸化(含5个磷酸基团)不同，人乳β-酪蛋白有6种磷酸化水平(含有 0，1，2，3，4 和 5 个磷酸基团)［5］。有研究表明，磷酸基团对酪蛋白的消化、二价阳离子生物利用率，甚至是免疫系统造成的过敏反应都有一定的影响［6-7］。所以对牛乳酪蛋白脱磷酸化程度的研究，将有助于模拟人乳酪蛋白的磷酸化水平，提高其功能特性，为婴幼儿配方乳粉等食品的生产提供更加优质的原料。

脱磷酸化有化学和酶学两种方法，前者反应条件剧烈，容易生成赖丙氨酸等副产物;后者反应条件温和，专一性好，无副反应［8］。目前国内外有关蛋白脱磷酸化的研究主要集中在酶的筛选和含磷量的检测，而酪蛋白磷酸化程度的精确鉴定却鲜有报道。因此，本研究选用马铃薯酸性磷酸酶制备不同脱磷酸化程度的β-酪蛋白和酪蛋白酸钠样品，并使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)［9］、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea-PAGE)和电喷雾离子化质谱(ESI-MS)鉴定磷酸化程度的变化，以便为今后系统研究脱磷酸化修饰的牛乳酪蛋白在婴幼儿乳粉配方中的应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马铃薯酸性磷酸酶、β-酪蛋白、α-酪蛋白、酪蛋白酸钠(SC)，Sigma公司;甲酸、乙腈，赛默飞世尔科技(中国)有限公司;丙烯酰胺(Acr)、甲叉丙烯酰胺(Bis)、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-base)、尿素，美国Amresco公司;盐酸、SDS、甘氨酸、三氯乙酸、甘油、甲醇、冰醋酸、乙醇、过硫酸铵、β-巯基乙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝均为分析纯。

RC透析膜，上海绿岛科技发展有限公司;HWS26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司;BenchTop Pro冷冻干燥机，美国 VirTis公司;EL204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Heraeus Multifuge XIR冷冻离心机，Thermo;ProteanⅡxi Cell电泳仪，美国Bio-rad公司;GelDox XR凝胶成像仪，美国Bio-rad公司;Platform ZMD 4000液质联用仪，美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同程度去磷酸化酪蛋白的制备

马铃薯酸性磷酸酶溶解于pH 6.80的Tris-HCl缓冲液中，与5 mg/mL的β-酪蛋白或者酪蛋白酸钠溶液按1∶1比例混合。混合之后立即高温灭活，得到未脱磷的酪蛋白样品溶液;混合之后37℃水浴反应一段时间再高温灭活，得到部分脱磷的酪蛋白样品溶液。未脱磷的和部分脱磷的酪蛋白样品溶液先在4℃透析，然后再冷冻干燥。

1.2.2 SDS-PAGE

浓缩胶和分离胶的浓度分别是4%和12%，将1.2.1的样品溶液与样品缓冲液按1∶1的比例混合，加入β-巯基乙醇和0.05%的溴酚蓝，沸水中煮3 min后冰浴冷却。上样后浓缩胶和分离胶的电流控制在每块胶板30 mA和60 mA，4 h后取下胶板染色。染色结束后用脱色液脱色，每隔1 h更换1次脱色液，至胶板背景变为无色透明。脱色后的胶板用凝胶成像仪拍照，然后保存在脱色液中。

1.2.3 Urea-PAGE

浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为10%，样品溶液与Urea样品缓冲液1∶1混合后加入β-巯基乙醇和0.25%的溴酚蓝，混匀备用。每块胶上样量为30 μL，浓缩胶和分离胶电压为280 V和300 V。6 h后取出胶板染色8 h，再用超纯水脱色至胶板背景干净透明。脱色后的胶板用凝胶成像仪拍照，储存在超纯水中。

1.2.4 LC-MS

β-酪蛋白和酪蛋白酸钠的脱磷酸化程度用超高效液相电喷雾离子化飞行时间质谱(UPLC-ESI-TOF MS)鉴定。将蛋白样品溶于pH8.0的氨水溶液中，10 000 g常温离心5 min，取上清液过0.45 μm的滤膜，滤液进行液质联用鉴定。

色谱条件:选用BEC C4(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美国Waters公司)色谱柱，流动相A液和B液分别是100%的乙腈和0.1%的甲酸，B液从90%到0再降到90%进行梯度洗脱。

质谱条件:离子化选用阳离子模式(+ESI)，锥孔电压40 V，碰撞能量6 eV，质荷比(m/z)500～3 000，扫描时间1 s，扫描时间间隔0.02 s。用Mass-Lynx V 4.1和MassEnt 1软件(Waters)分析数据。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE鉴定不同程度去磷酸化酪蛋白

β-酪蛋白和酪蛋白酸钠酶法脱磷酸化修饰前后的SDS-PAGE如图1所示。与泳道1相比，泳道3中除了β-酪蛋白的条带外，下端还有其他的条带，说明β-酪蛋白发生了水解反应，形成小的肽段。从泳道4可以看出，随着反应时间的延长，小的肽段条带颜色加深，说明β-酪蛋白进一步水解，而蛋白水解现象在酪蛋白酸钠中并不明显。分析比较泳道5和6发现，相比标准品，α-和β-酪蛋白的条带略有下移，但不能区分修饰后的酪蛋白与未修饰的酪蛋白。在SDSPAGE中，条带的迁移率主要取决于蛋白的分子量。小分子蛋白通过凝胶孔径的阻力小，迁移速度快，而大分子蛋白受到较大的阻力，迁移速度慢，因此能与小分子蛋白分离［9］。以β-酪蛋白为例，即使完全脱磷酸基团后，其分子量也只降低400 Da左右，这远远小于 β-酪蛋白 24 kDa左右的分子量，因此 SDSPAGE不适合鉴定不同程度酶法脱磷酸化修饰的酪蛋白。

图1 β-酪蛋白和酪蛋白酸钠脱磷酸化修饰前后SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE electrophoretic patterns of β-casein and SC before and after dephosphorylation modification

2.2 Urea-PAGE鉴定不同程度去磷酸化酪蛋白

在Urea-PAGE中，尿素作为蛋白质变性剂，消除蛋白质分子内和分子间的氢键及疏水相互作用，解离肽链折叠，与蛋白质形成新的复合物。新的复合物在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率，不再受蛋白质分子原来的电荷和形状的影响，而取决于新复合物的电荷量、以及分子量的大小。磷酸基团的脱除使酪蛋白分子所带的净负电荷减少，从而等电点增加。β-酪蛋白和酪蛋白酸钠脱磷酸化程度的不同导致其在相同pH条件下所带的净负电荷不同，利用这一特性，使用U-rea-PAGE鉴定酪蛋白分子酶法脱磷酸化修饰的程度，结果如图2所示。从泳道4可以看到4条清晰的条带，并且迁移率都低于泳道3中的条带，它们代表了 β-酪蛋白 4 种(0、1、2、3)不同程度的磷酸化水平。脱磷酸化程度与磷酸盐的终产物抑制有关，其中磷酸盐是一种马铃薯酸性磷酸酶的竞争性抑制剂;带有3个磷酸基团的β-酪蛋白可以抵制磷酸酶的作用，这种抵制涉及到分子间相互作用［10］。泳道5中的2个条带说明酪蛋白酸钠中β-和α-酪蛋白是完全磷酸化的，而在酶解液中反应一段时间后，β-酪蛋白分成了4个条带，含有 1、2、3、4 个磷酸基团，α-酪蛋白也脱除了部分磷酸基团，形成了多个条带。因此，Urea-PAGE可以用来初步鉴定酪蛋白的磷酸化程度，能够较为清楚地分辨出β-酪蛋白的脱磷酸化程度。

图2 β-酪蛋白和酪蛋白酸钠脱磷酸化修饰前后Urea-PAGE图谱Fig.2 Urea-PAGE electrophoretic patterns of β-casein and SC before and after dephosphorylation modification

2.3 LC-MS鉴定不同程度去磷酸化酪蛋白

质谱技术可用来鉴定磷蛋白和含磷肽段中的磷酸基团［11］，当采用化学法脱除丝氨酸残基上的磷酸基团时，每脱除一个磷酸基团，磷酸丝氨酸残基的质量数就减少98 kDa(H3PO4)［12］;但是用酶法脱除丝氨酸残基上的磷酸基团时，只有HPO-3被脱除，保留了完整的丝氨酸残基，因此质量数减少80 kDa。本实验使用LC-ESI-MS方法检测酪蛋白去磷酸化的程度［13］。图3(a)为β-酪蛋白未脱磷时的去卷积质谱图。未脱磷β-酪蛋白的质量数为23 982.0 Da，与文献报导值一致，此时蛋白中含有5个磷酸基团［2］。有文献报道，酪蛋白在没有添加酶的情况下水浴，可以脱除1个磷酸基团［14］。部分脱磷的β-酪蛋白质量数分布如图3(b)所示。4种β-酪蛋白的质量数分别是23 823.0 Da、23 741.0 Da、23 662.0 Da 和 23 582 Da，与β-酪蛋白标准相比质量数减少了159 Da、241 Da、320 Da和400 Da，表明各脱除了2、3、4和5个磷酸基团。图3(b)上23 741.0 Da和23 662 Da处的两个峰信号最强，说明此时β-酪蛋白主要脱除了3个和4个磷酸基团，与图2中泳道4脱磷酸化β-酪蛋白的条带分布结果一致。

图3 β-酪蛋白脱磷酸化修饰去卷积质谱图Fig.3 Deconvoluted mass spectrum of β-casein after dephosphorylation modification

图4是酪蛋白酸钠中β-酪蛋白的去卷积质谱图。对于未脱磷的样品，β-酪蛋白的质量数为23 983.0 Da，有5个磷酸基团。图4(b)反映了部分脱磷后β-酪蛋白分子质量的变化，从23 983.0 Da变为23 903.0 Da、23 823.0 Da、23 743.0 Da 和 23 662.0 Da，减少了 80 Da、160 Da、240 Da 和 321 Da，分别脱除了1、2、3和4个磷酸基团，与Urea-PAGE中脱磷酸化β-酪蛋白的条带分布结果一致。

图4 酪蛋白酸钠中β-酪蛋白脱磷酸化修饰去卷积质谱图Fig.4 Deconvoluted mass spectrum of β-casein in sodium caseinate after dephosphorylation modification

图5 酪蛋白酸钠中α-酪蛋白脱磷酸化修饰去卷积质谱图Fig.5 Deconvoluted mass spectrum of α-casein in sodium caseinate after dephosphorylation modification

从图5(a)可以看出，酪蛋白酸钠中α-酪蛋白的质量数为23 612.0 Da，与Léonil等检测到的值(23 614 Da)吻合，此时 α-酪蛋白含有 8个磷酸基团［14］。部分脱磷的样品中，α-酪蛋白的质量数如图5(b)所示，分别为 23 452.0 Da、23 372.0 Da、23 292.0 Da 和23 214.0 Da，含有6个、5个、4个和3个磷酸基团。LC-MS不仅可以鉴定纯β-酪蛋白的磷酸化程度，还可以区分混合体系中各种蛋白的磷酸化程度的变化，如酪蛋白酸钠中的β-和α-酪蛋白。

3 结论

β-酪蛋白的分子质量为23982 Da，含有5个磷酸基团，在马铃薯酸性磷酸酶的作用下，对于部分脱磷酸化的样品，脱除了2、3、4、5个磷酸基团。对于酪蛋白酸钠，其部分脱磷酸化的样品中，β-酪蛋白脱除了1、2、3、4 个磷酸基团，而 α-酪蛋白脱除了 2、3、4、5 个磷酸基团。另外，β-酪蛋白在去磷酸化修饰的同时也发生了水解反应，而酪蛋白酸钠不易水解。

SDS-PGAE可以辨别分子质量相差较大的蛋白，观察蛋白是否发生降解，但是不适用脱磷酸化程度的研究。Urea-PAGE可以鉴定酪蛋白磷酸化程度的变化，尤其是β-酪蛋白，检测结果较为清晰。LC-MS得到的去卷积质谱图直观地反应了单一或混合体系中不同脱磷酸化程度酪蛋白的分子量分布，定性和定量分析酪蛋白中磷酸基团的变化。

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