温度对鸡骨酶解液美拉德反应产物光谱特性和挥发性风味成分的影响*

郑晓杰，林胜利，聂小华，许丹

1(温州科技职业学院(温州市农业科学研究院)，浙江温州，325006)

2(浙江工业大学海洋学院，浙江 杭州，310014)

鸡骨架是肉鸡加工过程中产生的主要副产物，约占胴体总重的8%～17%，含有丰富的蛋白质;但我国鸡骨架资源利用率差，且主要是加工成附加值低的动物饲料。近年来开始利用复合酶水解鸡骨架以开发食品调味品基料，由于鸡骨酶解液普遍存在着风味不足的缺点，美拉德反应成为了改善其产品整体风味的一种有效手段。已有研究表明，美拉德反应产物肉味强度比传统的煮鸡或烤鸡的肉味强80～100倍［1］。

目前鸡骨资源的研究多集中于酶解工艺［2-3］和酶解液美拉德反应工艺［4-5］等方面，而对鸡骨酶解液美拉德反应产物中挥发性风味成分等相关研究较少。本文拟在不同温度下(60～100℃)进行鸡骨酶解液-木糖体系的美拉德反应，分析其产物性质和挥发性风味成分的变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

冷冻鸡骨架，市售，去除其表层肌肉与脂肪;中性蛋白酶(4.7万U/g)、木瓜蛋白酶(60万 U/g)、胰酶(1 400 U/g)，购于河南华森食品配料有限公司。

752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;SpectraMax M2多功能酶标仪，美国MD公司;CR22N/CR21N高速冷冻离心机，日本日立公司;ISQ单四极杆GC-MS，美国热电公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡骨酶解液的制备

称取一定量的鸡骨，按1∶1.5(g∶mL)比例加入水后于130℃高压蒸煮20 min，匀浆后于50℃和自然pH下进行复合酶酶解，其中复合酶为中性蛋白酶、胰酶和木瓜蛋白酶(1∶2∶1)，酶底比为为2 200 U/g原料;酶解3.5 h后于100℃下处理15 min，冷却，离心去沉淀，上清液即为鸡骨酶解液。

1.2.2 鸡骨酶解液的美拉德反应

取鸡骨酶解液50 mL，加入木糖2.0 g，分别在60、80、100℃温度下反应90 min后，立即用冰水冷却以终止反应，即为鸡骨酶解液的美拉德反应产物。

1.2.3 pH的测定

采用数字酸度计直接测定。

1.2.4 游离氨基的测定

采用邻苯二甲醛法(OPA法)测定游离氨基的含量［6］。将鸡骨酶解液美拉德反应产物稀释100倍，取0.1 mL稀释液与3 mL 0.05 mol/L硼砂缓冲溶液(含0.8 mg/mL OPA，1%SDS，2 μg/mL β-巯基乙醇)混匀，室温下反应3 min，于340 nm下测定吸光度。以赖氨酸绘制标准曲线，吸光值转换为赖氨酸浓度当量。

1.2.5 中间产物和褐变程度的测定

将美拉德反应产物进行适当的稀释，采用紫外可见光分光光度计分别在294 nm和240 nm处测定吸光值。

1.2.6 荧光光谱分析

将美拉德反应产物稀释50倍后，采用Spectramax M2多功能酶标仪分别在激发波长347 nm进行发射波长扫描(300～600 nm)。

1.2.7 挥发性风味成分的分析

固相微萃取:选用65 μm PDMS/DVB探头，老化温度250℃，老化时间30 min。样品瓶于55℃下恒温萃取40 min，顶空取样。

色谱条件:色谱柱为TG-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，高纯氦气为载气，柱流量 1 mL/min。进样口温度230℃，不分流，进样量1 μL。初始柱温40℃，保持3 min，以5℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持15 min，流速30 mL/min。

质谱条件:电子轰击(EI)离子源，电子能量70 eV，离子源温度280℃，传输线温度250℃，质谱扫描范围35～500 amu。

2 结果与讨论

2.1 鸡骨酶解液美拉德反应产物pH值和游离氨基的变化

在美拉德反应初期，蛋白质、肽类或氨基酸的α-或ε-氨基与还原糖类羰基发生共价结合，消耗游离氨基;随着反应的进行还会生成甲酸、乙酸和丙酮酸等酸性物质，导致反应体系pH值进一步下降［6］。因此，pH值和游离氨基是衡量美拉德反应程度的重要指标。

图1 温度对鸡骨酶解液美拉德反应产物pH和游离氨基的影响Fig.1 Effect of temperature on pH and free amino group of MRPs from chicken bone protein hydrolysate

由图1可知，鸡骨酶解液与木糖发生美拉德反应后，其pH值发生显著下降，由起始的6.09分别降至4.77～4.45。郭丽萍等亦在半乳糖-赖氨酸美拉德反应模式的研究中发现，加热200 min后反应体系pH由5.0显著降至3.6～3.8［7］。鸡骨蛋白经酶解后可生成氨基酸和小分子肽类，易与还原糖发生美拉德反应。但各美拉德反应产物之间不存在显著性差异，这主要是因为弱酸条件下美拉德反应进程缓慢，从而无法体现出不同温度下鸡骨酶解液美拉德反应产物pH之间的差异。

鸡骨酶解液美拉德反应产物中游离氨基亦明显减少，其含量损失随着加热温度的增加而增加，表明游离氨基在较高的温度下更快地连接到木糖的羰基上。在100℃下鸡骨酶解液与木糖的美拉德反应比较彻底，游离氨基由起始的388.23 mmol/L降至303.63 mmol/L，损失率为21.79%。实验中较低的游离氨基损失主要是由于弱酸条件不利于美拉德反应的进行;Jiang等［8］也报道了相似结论，酪蛋白与半乳糖在pH 5～6、95℃下发生美拉德反应2 h，自由氨基损失率较低，约为15%～20%;只有当pH ＞9.0时自由氨基才被大量消耗。

2.2 鸡骨酶解液美拉德反应产物中间产物生成和褐变程度的变化

美拉德反应高级阶段，糖类物质裂解生成酮、醛类等无色小分子中间产物，该类产物自身或相互间聚合生成类黑精等大分子褐色物质，使体系表现出显著的颜色特征。因此常用中间产物特征吸收A294nm和褐变程度A420nm来检测美拉德反应进行的程度。由图2可知，鸡骨酶解液美拉德反应产物中A294nm和A420nm值均随着加热温度的增加而快速增加，且两者之间存在一定的正相关性，说明美拉德反应过程中间产物形成的同时伴随着其聚合生成褐色物质，该结果与孟艳丽［9］、Guan［10］等的研究相一致。鸡骨酶解液与木糖在100℃反应90 min后，美拉德反应产物A294nm和A420nm分别比对照组增加了5.76倍和7.35倍。此外，鸡骨酶解液美拉德反应产物中间产物生成、褐变程度均与游离氨基的含量损失存在正相关。

2.3 鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物荧光光谱的变化

美拉德反应高级阶段降解形成的小分子物质，具有一定的荧光吸收特性，通常被认为是褐色物质形成的前体物，其荧光强度表征了荧光小分子物质的产生状态。由图3可知，鸡骨酶解液在发射波长345 nm处时有最大荧光强度，一般认为是蛋白质Phe、Trp或Tyr残基的内源性荧光;鸡骨酶解液美拉德反应产物在该处的荧光强度随着加热温度的增加而显著减少，同时在450 nm附近出现新的荧光吸收峰，符合美拉德反应产物的荧光特征，其荧光强度随着加热温度的增加而逐渐增加，其中100℃时产物的荧光强度最大。刘平等人在研究二甘肽-木糖美拉德反应体系时亦发现了347 nm和430 nm两处荧光吸收峰［11］。此外，鸡骨酶解液美拉德反应产物的荧光强度与中间产物生成(A294nm)存在一定的正相关，两者均表明了美拉德反应中间产物的形成。

图2 温度对鸡骨酶解液美拉德反应产物中间产物生成和褐变程度的影响Fig.2 Effect of temperature on the and browning of MRPs from chicken bone protein hydrolysate

图3 温度对鸡骨酶解液美拉德反应产物荧光光谱的影响Fig.3 Effect of temperature on fluprescent spectra of MRPs from chicken bone protein hydrolysate

2.4 鸡骨酶解液美拉德反应产物挥发性风味成分的变化

由表1可知，鸡骨酶解液总共鉴定出21种挥发性风味成分，其中烃类4.90%、醇类30.70%、酚类0.2%、酯类2.70%、醛酮类40.50%等;其与木糖发生美拉德反应后挥发性风味成分明显增加，如酮醛酯类化合物种类增多，且出现了酸类和杂环类化合物，其中噻唑、呋喃和吡嗪等杂环类化合物对于肉香风味形成起到重要的贡献。

醇类化合物由于风味阈值较高，在美拉德反应产物的总体风味中主要起协同作用，同时可作为风味前体物质参加后期的反应。与鸡骨酶解液相比，美拉德反应产物中鉴定出2-己烯-1-醇和2-乙基-1-己醇，这两种醇类具有温和油脂味和花果香，董庆利等在低温蒸煮香肠中发现了2-己烯-1-醇［12］，赵景丽则在研究金华火腿挥发性风味物质中分析出2-乙基-1-己醇［13］。此外辛醇和 3，7-二甲基-1，6-辛二烯 3-醇具有清纯的花果香，可能影响着产物整体风味。

醛酮类化合物主要来源于脂肪的热氧化降解以及氨基酸的降解。鸡骨酶解液美拉德反应产物中己醛和壬醛明显减少，可能是加热过程中转化成羧酸等其他挥发性成分;而己醛的气味特征与含量有关，含量高时产生强烈的脂肪酸败和腥味，浓度低时呈现清香的青草气味［14］，因此己醛含量的降低有利于产品整体风味的提高。同时美拉德反应产物中还鉴定出苯甲醛和苯丙醛，其中苯甲醛具有杏仁香和焦糖香，孙红梅等还认为苯甲醛有助于赋予产品脂香风味［15］。此外，100℃下鸡骨酶解液美拉德反应产物还鉴定出1-乙基硫代-丙酮、2-庚酮和2-十二烷酮等甲基酮，亦是产物肉香风味形成的重要组成物质。

酸类化合物可能由醛酮类化合物高温氧化得到或长链脂肪酸降解生成。鸡骨酶解液未鉴定出酸类化合物，而美拉德反应后其产物中鉴定出2-己烯基己酸、2-甲基-2-戊烯酸、辛酸、异辛酸、庚酸、壬酸、癸酸和十三酸等有机酸，多数酸类化合物具有清甜的水果香气，被认为是有效的风味修饰剂。

酯类化合物是羧酸和醇的酯化产物，一般认为对肉香形成没有特殊贡献。除邻苯二甲酸二异丁酯和邻苯二甲酸二丁酯外，鸡骨酶解液美拉德反应产物中还分别鉴定出羟基十一酸内酯、丙位十二内酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸甲酯和棕榈酸异丙酯等，其中前两者可赋予产品产物清香气味，而肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸甲酯和棕榈酸异丙酯等长链脂肪酸酯可能使产品整体风味更浓厚和协调［16］。

杂环类化合物是肉香重要特征风味物质，主要来源于氨基酸和还原糖的美拉德反应。赵景丽［12］、王旭［17］等指出，美拉德反应过程产生大量的呋喃、吡咯、噻吩、吡啶和噻唑等杂环类化合物，多数该类化合物阈值较低，具有强烈的烤肉香、焦香和坚果香等风味特征。且高温是形成杂环化合物的先决条件，由表1可知，加热温度越高，鸡骨酶解液美拉德反应产物中形成的噻唑、呋喃、吡嗪等杂环类化合物种类和含量越多，100℃下鸡骨酶解液美拉德反应产物中鉴定出杂环类化合物有苯并噻唑、3-乙基呋喃、2-氨基-4-甲基噻唑、2，3-二乙基吡嗪、糠醛、2，6-二甲基吡嗪，其中3-乙基呋喃和2，6-二甲基吡嗪相对含量较高。此外，2-氨基-4-甲基噻唑、2，3-二乙基吡嗪和糠醛作为重要的肉香物质，对产品整体风味的形成作用不可忽视。

表1 鸡骨酶解液美拉德反应产物挥发性风味成分的GC-MS分析结果Table 1 GC-MS result of volatile compounds in MRPs from chicken bone protein hydrolysate

续表1

3 结论

温度是影响鸡骨酶解液美拉德反应产物性质和挥发性风味成分的一种重要因素。随着温度的升高，鸡骨酶解液美拉德反应产物中pH显著下降，游离氨基减少;中间产物和褐变程度增加，均与温度呈现正相关性;加热温度越高，鸡骨酶解液美拉德反应产物中挥发性风味成分明显增加，且出现了较多的醛酮类、酸类和杂环类化合物，如苯甲醛、1-乙基硫代-丙酮、2-庚酮、肉豆蔻酸异丙酯、3-乙基呋喃、2-氨基-4-甲基噻唑、2，3-二乙基吡嗪、糠醛和 2，6-二甲基吡嗪等，有利于肉香风味形成。

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