玛咖发酵酒工艺优化*

涂行浩，张弘，郑华，张雯雯，宋国彬，徐涓

1(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南昆明，650224)

2(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东湛江，524091)

近年来，玛咖(Lepidium meyenii Walp.)作为现代保健品和天然药物，受到越来越多的国际植物学专家和医药专家的关注［1-2］。以玛咖块根为主要原料生产的保健酒，可更充分地发挥其醇溶性功效成分［3-4］的作用，拓展玛咖产品领域。目前，对玛咖酒的研究倾向于采用2种方法，一是单独浸泡［5］或将玛咖与其他水果或中药材(如葡萄、红景天、枸杞等)配伍浸泡［6-8］，但这种浸泡不能高效提取玛咖中多种营养和功效物质，且产品常有异味;二是将玛咖同葡萄等高糖含量的水果一同发酵制酒［9-11］。本研究采用玛咖单独发酵制酒技术，以响应面法优化主要工艺条件，期望能充分保留其芥子油苷、生物碱等特殊功效成分，满足人体的保健需求并具有果酒的口感，减少和消除异味，为玛咖资源综合利用和新产品的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自然干燥玛咖块根，由中国林业科学研究院资源昆虫研究所滇中高原试验站提供，用中药粉碎机粉碎后过筛。主要成分含量(%):水分6.93、蛋白质10.16、总糖 39.98、淀粉 29.16、芥子油苷 1.56、生物碱0.38。

安琪牌活性酿酒酵母，安琪酵母股份有限公司;α-淀粉酶、糖化酶、盐酸小檗碱，上海阿拉丁化学试剂有限公司;黑芥子硫苷酸钾(纯度≥99.0%)，Sigma公司;甲醇、乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、溴麝香草酚蓝、CHCl3、无水CaCl2，国药集团化学试剂有限公司(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

DYQ-401B参茸中药切片机、中药粉碎机，浙江瑞安市永历制药机械有限公司;MM400型冷冻混合球磨仪，德国Retsch公司;AB204-S精密型电子天平、HR83-P型快速卤素水分测定仪，Mettler Toledo中国有限公司;HH-6型数显恒温水浴锅，常州澳华科技有限公司;Epsilon 1-4中试型冻干机，德国Christ公司;BCD-539WT冰箱，青岛海尔股份有限公司;TY742X2A纯水机，美国Barnstead公司;10～1 000 μL手动可调量程单道移液器，德国Eppendorf公司;EYELA.MTI-201温度梯度恒温箱，东京理化器械株式会社;Z323K通用型高速冷冻离心机，德国Hermie公司;DU800型紫外-可见光分光光度计，美国贝克曼库尔特有限公司;Acme 6100 GC气相色谱仪，韩国英麟机器株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1 玛咖发酵酒生产工艺流程及操作要点

将玛咖粉加入适量水搅拌混匀，置于实验专用微波炉内进行预处理，600 W加热1 min，取出冷却，先加入α-淀粉酶液化，60℃、pH 6.0～6.5条件下液化24 h，再加入糖化酶糖化，60℃、pH 4.0～4.5条件下糖化24 h，最后加入活化的酿酒酵母、适量SO2、控温发酵8 d。灭菌离心分离得到原酒，将酒液装瓶后密封于70℃巴氏杀菌20 min，冷藏检测。

1.3.2 发酵温度的确定

在料液比1∶7、酵母添加量0.6%、发酵至 pH 4.5时，根据预试验结果，选择发酵温度20、25、30、35、40℃分别控温发酵，测定乙醇产量、芥子油苷浸出率，根据试验结果选择合适的发酵温度进行工艺优化。

1.3.3 料液比的确定

分别选择料液比 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9。对 5 g原料，先后在糊化、液化、糖化和酵母菌接种阶段分别加入水(其中糊化阶段加10 mL)。控温发酵，测定酒精产量、芥子油苷浸出率，根据试验结果选择合适的料液比进行工艺优化。

1.3.4 酵母接种量确定

在料液比1∶7、发酵 pH 4.5、温度25℃时，选择0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%酵母添加量，控温发酵，测定乙醇产量、芥子油苷浸出率，从而选择合适的酵母添加量进行工艺优化。

1.3.5 分析测定方法

乙醇含量、总芥子油苷、总生物碱、残糖测定分别采用气相色谱法法［12］、氯化钯法［4］、酸性染料比色法［1］、折光糖度计直接测定法测定。乙醇产量以每100 g干玛咖粉发酵产乙醇体积表示。芥子油苷以及总生物碱浸出率分别采用式(1)和(2)计算:

式中，y1为芥子油苷浸出率;m1为玛咖发酵酒中芥子油苷含量;m2为玛咖粉中芥子油苷含量;y2为总生物碱浸出率;m3为玛咖发酵酒中总生物碱苷含量;m4为玛咖粉中总生物碱含量。

残余 SO2总量的测定按《GB/T5009.49—2008发酵酒及其配制酒卫生标准的分析方法》［13］测定。重金属、有害微生物的检测按《GB2758—2005发酵酒卫生标准》［14］测定。酒中游离氨基酸成分分析:取10 mL酒样，加10 mL 8%磺基水杨酸溶液，并加0.1 g活性炭进行脱色处理，充分摇匀，于4℃冰箱内静置2 h，以8 000 r/min 离心 15 min，用 0.45 μm 微孔膜过滤。取透明滤液1.0 mL，用0.1 mol/L HCl稀释至25 mL，用氨基酸分析仪分析测定［15］。玛咖发酵酒感官检测按《GB15037—2006 葡萄酒》［16］检测。

2 结果讨论

2.1 各单因素处理对乙醇及芥子油苷含量的影响

2.1.1 发酵温度对玛咖发酵酒中乙醇和芥子油苷含量的影响

果酒酵母生长繁殖的适宜温度为22～25℃，一般来说，酵母生长及发酵的速度随温度升高而加快，温度较高时，发酵剧烈、起酵快，但酵母衰老快，反而导致生成酒精质量分数低，挥发性香气成分损失较多，且腐败微生物易在高温条件下生长发育，使果酒质量下降。此外，果酒酵母不耐高温，没有乙醇时，温度超过35℃会影响酵母繁殖，在40～45℃条件下1 h即可致死，而在含有10%乙醇的条件下，致死温度仅为30℃［17］。如图1所示，玛咖发酵酒乙醇产量，随发酵温度的升高呈现先增加后降低的趋势，25℃时达到最高;由图1中芥子油苷含量的变化趋势可见，25℃时乙醇产量也达到最大值，且此时芥子油苷浸出率也较高。温度继续升高，芥子油苷浸出率上升趋势不明显，故选择发酵温度25℃为中心点，20～30℃区间进行优化较为合适。

图1 发酵温度对乙醇产量及芥子油苷浸出率的影响Fig.1 The effect of the temperature on alcohol production and leaching rate of glucosinolates

2.1.2 料液比对乙醇和芥子油苷含量的影响

料液比对乙醇和芥子油苷含量的影响如图2所示。玛咖发酵酒乙醇产量随料液比的增加而增加，但超过1∶7后，乙醇产量增加趋势不明显，料液比的增加稀释了溶液浓度，从而导致体积分数下降较明显。芥子油苷既是醇溶性物质，也是水溶性物质，料液比增加在总体上有利于芥子油苷的溶出。由图2可知，随着料液比的增加，芥子油苷浸出率一直呈上升趋势，料液比为1∶7时，芥子油苷浸出率能达到57.1%。在乙醇产量较高的情况下，兼顾考虑芥子油苷浸出率与玛咖发酵酒的乙醇体积分数，综合选择料液比为1∶7为中心点，在料液比1∶5 ～1∶9进行优化较为合适。

图2 料水比对乙醇产量、芥子油苷浸出率以及乙醇体积分数的影响Fig.2 The effect of the content of yeast on ethanol volume fraction and glucosinolates

2.1.3 酵母添加量对乙醇和芥子油苷含量的影响

由图3可知，乙醇体积分数随酵母添加量的增加而增加，当酵母添加量增加到0.8%以后，乙醇体积分数的增加趋于平缓。这是因为酵母能使糖完全发酵，酵母添加量增加则糖的发酵量也相应增加。但由于含糖量有限，当完全发酵后，继续增加酵母添加量，乙醇含量也不再增加。由图3中芥子油苷含量变化趋势可见，酵母添加量为0.8%时乙醇含量达最大，而此时芥子油苷含量也处于较高水平，综合乙醇含量及芥子油苷含量，选择酵母添加量0.8%为中心点，在0.4%～1.2%进行优化最佳。

图3 酵母添加量对乙醇体积分数及芥子油苷浸出率的影响Fig.2 The effect of the content of yeast on alcohol production and leaching rate of glucosinolates

2.2 玛咖发酵酒工艺参数的响应面优化

2.2.1 玛咖发酵酒条件优化

在单因素试验基础上，利用Design-expert 7.1.3软件，采用中心组合试验设计，以影响玛咖发酵酒的3个主要因素发酵温度、料液比和酵母添加量为响应变量(分别用A、B和C来表示)，乙醇产量及芥子油苷浸出率为响应值进行响应面优化，试验因素水平设计见表 1［18］。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels for RSM

2.2.2 工艺模型建立及其显著性检验

结合单因素实验结果，利用Design-Expert软件，按CCD中心组合实验设计原理进行3因素3水平实验，以乙醇产量和芥子油苷浸出率为响应值，通过响应曲面法进行优化，以期望得到玛咖发酵酒最佳工艺条件。实验设计如表2所示。

表2 中心组合设计实验结果Table 2 Central composite design matrix and experimental results

将所得的试验数据用Design Expert软件进行多元回归拟合，得到以玛咖发酵酒乙醇产量及芥子油苷含量为目标函数的二次多项回归方程，结果见表3。由表3可知，得到的2个数学拟合模型Y1和Y2的R2值分别为0.984 3和0.932 2，其值均接近1，表明模型与试验拟合度较好，结果具有较高的可靠性，可用于分析和预测玛咖发酵酒工艺中乙醇产量和芥子油苷浸出率。

为检验方程的有效性，对上述回归模型进行方差分析(表4)。从表4回归方程系数检验可以看出，各发酵因素的改变对2个响应值的影响不是简单的线性关系，而是各因素存在交互作用的影响，如乙醇产量模型的一次项B、C极显著，而A显著;交互项AB、AC显著，BC不显著;二次项A2、C2极显著，B2显著。芥子油苷模型的一次项 A、B、C均极显著;交互项AB、AC 显著，BC 不显著;二次项 B2、C2极显著，A2显著。结合F值的大小，可知影响玛咖发酵酒乙醇产量主效应关系为酵母添加量＞料液比＞发酵温度;影响芥子油苷浸出率的主效应关系为料液比＞发酵温度＞酵母添加量。

表3 玛咖酒乙醇及芥子油苷含量回归模型拟合结果Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

表4 玛咖酒乙醇及芥子油苷含量方差分析结果Table 4 Significance test for regression coefficients of the fitted regression model

2.2.3 响应面分析及最优条件的确定

根据回归方程作出模型的响应曲面及等高线见图4。图4较直观地反映了任何两因素的交互影响，以及各因素对2个响应值的影响。本实验主要以酒精产量和功效成分芥子油苷浸出率为响应指标，讨论玛咖发酵酒的最佳制备工艺条件，利用Design-expert7.1.3软件对试验结果进行优化，得到最佳工艺条件并在圆整条件下进行验证。

由图4结果可知，发酵温度、料液比以及酵母添加量均对玛咖发酵酒酒精产量和芥子油苷浸出率有较大程度的影响，且各因素之间有非常明显的交互作用。由于本实验主要关注玛咖粉中的淀粉和糖质成分是否发酵完全并得到有较高乙醇体积分数和富含芥子油苷成分的保健酒，因此选择乙醇产量重要性为5，芥子油苷浸出率重要性3，乙醇产量目标值为31.58～500的最大值响应，芥子油苷浸出率目标值为46.9～100的最大值响应，预测得到较佳的发酵工艺条件为:发酵温度25.13℃，料液比7.96，酵母添加量9.5 g/L，在此条件下响应面模型预测的玛咖发酵酒乙醇产量为40.97 mL/100 g，芥子油苷浸出率为57.69%。

图4 各因素对乙醇产量及芥子油苷浸出率影响的响应曲面图Fig.4 Response surface plot and its contour plot showing the effect of three factors on alcohol production and leaching rate of glucosinolate

2.3 验证试验

根据模型预测值，圆整发酵工艺条件为:发酵温度25.0℃，料液比8.0，酵母添加量9.5 g/L，在该条件下进行3次平行确证试验，取平均值。实际测得的玛咖发酵酒酒精产量为41.16 mL/100g，与预测值相差0.19 mL/100g，芥子油苷浸出率为57.53%，与预测值相差0.16%，实际值与预测值均相差不大，说明该方程与实际情况拟合良好，证明用响应曲面法预测玛咖发酵酒工艺条件是可行的。

2.4 常规指标检测

经检测，由优化工艺条件制得的玛咖发酵酒中，芥子油苷含量为0.827 g/L，浸出率为57.53%，生物碱含量为0.192 g/L，浸出率为42.71%，固形物质量分数为4.065 g/L，总酸质量分数为2.6 g/L，总酯质量分数为0.146 1 g/L，干浸出物为20.56 g/L，卫生指标中游离SO2未检出，重金属铅、汞未检出，肠道致病菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等未检出。其中固形物质量分数偏高可能是由于玛咖发酵酒中其他物质溶出，改变了酒的风味，同时使酒样中固形物质量分数增高。玛咖发酵酒中氨基酸种类齐全，共检测出17种氨基酸(色氨酸未检测)，氨基酸总量达到862.01 mg/100 mL，其中脯氨酸的含量非常高，达到602.52 mg/100 mL。一般在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻)，植物体内脯氨酸的含量会显著增加，在一定程度上反映了植物的抗逆性，可作为植物抗寒育种的生理指标［18］，这与玛咖一般在高寒山区种植的情况吻合。另外，由于脯氨酸亲水性极强，也可能导致其在玛咖发酵过程中大量溶入发酵酒内。除脯氨酸以外，其他氨基酸的组成合理，其中必需氨基酸的含量达到61.27 mg/100 mL，具有抗中枢疲劳作用的3种氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)含量高达37.89 mg/100 mL。

2.5 感官指标

色泽:呈棕红色，清亮透明;香气:有玛咖的特殊风味，略带醇香，无异味，余味悠长;口感:入口平顺，略带酸涩;风格:具玛咖发酵酒独特风格。

3 结论

发酵前处理:发酵前对玛咖粉微波处理后，表面较疏松，细胞破碎程度较大，以糊化态存在。有利于淀粉、生物碱、芥子油苷、糖类等细胞内物质溶出，且采用微波技术对玛咖进行处理较蒸煮处理时间短，操作简单，可有效减少水分蒸发和功效成分损失，适用于玛咖发酵前处理工艺。

玛咖发酵酒最佳发酵工艺条件为:发酵温度25℃、料液比1∶8(g∶mL)、酵母接种量0.95%。该条件下所得玛咖酒的乙醇产量为41.16 mL/100 g，芥子油苷浸出率57.53%、生物碱浸出率42.71%。产品颜色棕红，清亮透明，酒体协调，略带醇香，具玛咖特殊气味，氨基酸组成合理，主要卫生指标合格，顺应了现代人提倡适量饮用低度营养发酵酒的健康理念。

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