七氟醚预处理对体外循环下行心脏直视手术患者血特异性m iRNA-1的影响

段晓霞，张代英，毛安琼，龙 翔，王晓斌

（泸州医学院附属医院麻醉科，四川泸州646000）

七氟醚预处理对体外循环下行心脏直视手术患者血特异性m iRNA-1的影响

段晓霞，张代英，毛安琼，龙 翔，王晓斌

（泸州医学院附属医院麻醉科，四川泸州646000）

目的 探讨七氟醚预处理对体外循环（CPB）手术患者围术期血心肌特异性miRNA-1（miR-1）表达水平

甲醚类； 体外循环； 心肌缺血； 微RNAs； 心脏外科手术

随着麻醉技术、深低温体外循环（CPB）技术等的开展，通过CPB手术改善心脏功能、提高生活质量的患者正日益增加。但是CPB下行心脏直视手术常伴心肌缺血损害，这在一定程度上影响手术治疗患者的远期生存率[1]。目前常用评价心肌损害程度的指标有：cTnI、CKMB。然而这2项指标在特异度、灵敏度方面都有一定的缺陷，且本课题组的前期研究也证实，cTnI、CK-MB可反映CPB下心脏直视手术患者实时心肌损害，但不能反映心肌累积损伤程度，而miR-1是反映CPB下心脏直视手术患者心肌缺血再灌注期间累积损伤程度的生物学标志[1]，从而弥补了心肌酶学指标的这一缺陷。据报道，七氟醚预处理能减少CPB围术期血cTnI、CK-MB的释放[2]，保护心肌；但七氟醚是否会影响该类患者血miR-1的表达、不同浓度的七氟醚影响程度是否不同，目前国内外鲜见相关报道。因此，本研究拟探讨七氟醚预处理对CPB下心脏直视手术患者围术期血miR-1表达水平的影响[3]，分析血miR-1表达水平的变化与七氟醚预处理浓度的相关性，进一步阐明七氟醚预防围术期心肌缺血损伤的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年10月至2014年6月本院胸心外科拟行CPB下心脏直视手术的患者；由医学伦理委员会批准，签署患者知情协议书，术前检查血心肌酶学和血气分析值均正常的40例患者纳入研究。拒绝纳入研究的患者；术前血心肌酶学和血气分析值明显升高；术中或术后6 h内死亡者排除本研究。应用SPSS19.0随机数字生成模块，将纳入对象随机分为两组，每组20例。A组行七氟醚预处理；B组给予常规CPB麻醉。两组患者均采用芬太尼为主的常规全凭静脉麻醉（TIVA）。常规检测患者各项生命体征、用药情况。

1.2 方法

1.2.1 标本收集和处理 收集两组患者术前5min、术中（术后鱼精蛋白拮抗肝素后5min）和术后6 h血标本。离心后，去血清于-80℃保存，以备用于用miR-1的检测血。

1.2.2 标本检测方法 首先分离RNA，然后使用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测血清中miR-1的含量。使用德国Effdenf公司的微量移液泵取200μL每孔的血清标本，按1∶3比例，将标本与美国Invitrogen公司的TRIzol LS混合，充分振荡30～40 s。然后使用德国Qiagen公司的miRNA抽提试剂盒，按照操作说明将RNA分离。使用美国ABI公司提供的miR-1特异引物，引物编码为5-GT-CGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTC GGCAATTGCACTGGATACGACTACATAC-3，加样完成后，将样本放入美国Bio-Rad公司生产的Bio-Rad生物分析仪，并检测miR-1的阈循环值（CT）。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，采用非成对t检验对资料进行统计评价，使用线性相关回归分析七氟醚浓度与血miR-1的关系。本次研究主要使用独立样本t检验，按照，检验水准α=0.05，功效1-β=0.8、 Cohen′s d=1。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 纳入患者术前心肌酶学指标和血气分析结果均未见明显异常，两组患者术前性别、手术类型等相关情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 两组患者升主动脉阻断时间、各时间点平均动脉压比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 两组患者术中和术后6 h血miR-1含量明显高于术前，且B组患者含量均明显高于同时间点A组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 两组患者不同时间点血m iR-1Ct值、相差倍数情况比较

图1 患者不同时间点血m iR-1 PCR循环情况

2.4 七氟醚预处理浓度与术中及术后6 h血miR-1升高的倍数呈负相关（r=-0.41、-0.81，P＜0.05）。见图2、表2。

图2 七氟醚浓度与各时间点m iR-1升高倍数的相关性

表2 手术前后不同七氟醚预处理浓度m iR-1升高的倍数（±s）

表2 手术前后不同七氟醚预处理浓度m iR-1升高的倍数（±s）

七氟醚浓度（％）时间术中术后6 h 0.25 10.2±3.2 36.2±7.6 0.50 8.2±2.4 30.2±6.5 1.00 7.1±1.8 24.8±7.7 1.50 5.7±1.1 21.0±8.0 2.00 4.9±1.2 18.1±4.2时间 七氟醚浓度（％）术中术后6 h 2.50 3.9±0.8 12.3±4.2 3.00 1.9±0.8 8.9±2.1 3.50 1.1±0.8 7.2±1.5 4.00 0.9±0.1 6.7±2.1

3 讨 论

CPB下心脏直视手术是治疗各类心脏疾病的有效措施，常伴心肌缺血损害，目前评价心肌损害程度的指标常用的有血cTnI、CK-MB，然而这2个指标在特异度、灵敏度方面都有一定的缺陷，且作者前期研究也证实血cTnI、CK-MB可反映CPB下手术患者实时的心肌损害，而不能反映心肌累积损伤程度，而血miR-1是反映CPB下手术患者心肌缺血再灌注期间累积损伤程度的生物学标志[1]，从而弥补了心肌酶学指标的这一缺陷。

Landoni等[3]证实吸入麻醉药具有独特的心肌保护作用，其机制类似于心肌缺血性预处理，由此开辟了吸入麻醉研究的新领域，即脏器保护。研究证实，七氟醚预处理可缩小狗心肌缺血模型的心肌梗死面积[4]、减少CPB下手术患者或非心脏手术的冠心病患者围术期心肌损伤标志物的释放[5]、缩小冠心病患者心肌梗死面积、迅速恢复心脏泵血功能，但机制尚不清楚[6]。七氟醚对CPB下行冠状动脉搭桥术患者的心肌保护作用是确切的，而在其他瓣膜手术中虽不能减少cTnI的释放[7-8]，但可以改善手术患者的预后，这进一步说明七氟醚对CPB下手术患者的心肌有保护作用，而寻找一种更为敏感、特异性更强的指标来反映七氟醚对心肌的作用是一个值得探讨的问题。

miRNAs是细胞内的内源性、小的、非编码的RNAs，其通过切割或抑制mRNA。miRNAs通过翻译mRNA对相应靶目标蛋白表达进行负反馈调控[2-3]。正常发育、生理和疾病状态中，miRNAs是十分重要的调节因子[4-6]。相关研究表明，大多数疾病组织中都有miRNAs异常表达，而且不同的疾病其miRNAs表达种类是不一样的，甚至某些miRNAs是某些疾病特有的[7-8]。健康人或动物的心肌和骨骼肌组织中miR-1的含量较高，而在心脏相关疾病组织中miR-1含量会进一步升高，但在其他如动脉、肺、肾等组织中含量很低[9]。作者前期研究发现，miR-208a仅能在心肌组织中检测到[10]。因此，组织中相应的特异性miRNA可作为诊断组织疾病的生物学标志之一；但在实际临床工作中一般不易获得活体疾病组织，临床上一般都是通过采集外周体液来解决相关问题。前期研究发现，急性心肌梗死患者的miR-1能释放进入血液循环，并在外周血中可检测到，其含量明显高于健康人，并证实miR-1是诊断临床急性心肌梗死的生物学指标[9]，同时作者还证实血miR-1是反映CPB下手术患者心肌缺血再灌注期间累积损伤程度的生物学标志。遗憾的是，到现在为止，外周血中miR-1在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制不是十分清楚，其诊断价值也有待进一步探讨，miR-1的含量是否像cTnI、CK-MB受吸入麻醉药预处理等作用的影响也未明了，七氟醚对心肌的保护有目共睹，因此本研究选择七氟醚预处理来探寻吸入麻醉药预处理和miR-1间可能的作用。

据报道，从麻醉诱导起到CPB下心脏停搏、麻醉机停机前吸入最低肺泡有效浓度（MAC）为0.25％～4.00％的七氟醚能减少围术期血cTnI、CK-MB的释放[1]，保护心肌；本研究意在通过七氟醚预处理后，检测CPB下心脏直视手术患者围术期血miR-1表达水平的变化，验证miR-1能否作为评价七氟醚预处理后心肌保护作用的指标，从分子生物学角度进一步阐明七氟醚预防围术期心肌缺血损伤的机制，从而开拓七氟醚在临床应用中的又一路径，为心肌保护的研究开辟一个新思路、新领域。本研究结果显示，两组患者术中、CPB结束后6 h，2个时间点血miR-1含量明显高于术前，与A组患者比较，同时间点B组患者含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），七氟醚预处理浓度与术中及术后6 h血miR-1升高的倍数呈负相关（r=-0.41、-0.81，P＜0.05）。说明七氟醚预处理不但可以降低心肌酶学指标的含量还可降低血miR-1含量，因此作者可以推断七氟醚不但可以减轻CPB下手术对心肌的实时损伤，还能减轻CPB期间心肌累积损伤，这为改进麻醉方法、提高CPB患者生活质量开辟了新的途径。

通过检查CPB手术围术期3个时间点血中心肌特异性miR-1的含量情况分析，结果表明，使用七氟醚预处理的A组血miR-1较术前升高的倍数为8～32倍，而对照组B组血miR-1较术前升高的倍数为16～64倍，以上结果一方面再次证实作者前期研究认为“血miR-1可作为判断心肌缺血再灌注损伤的指标”的合理性，另一方面说明使用七氟醚预处理后血miR-1的含量明显较低，差异有统计学意义（P＜0.05）[1，9-10]。同时本研究发现，七氟醚预处理浓度与术中及术后6 h血miR-1升高的倍数呈负相关（r=-0.41、-0.81，P＜0.05），从图2中作者发现，当七氟醚预处理浓度在3％～4％时其相应miR-1下降不如浓度在0.25％～3.00％时明显，说明在一定浓度范围内七氟醚预处理浓度越高术中及术后6 h血miR-1升高倍数越小，而盲目加大七氟醚的浓度可能不会改善心肌缺血情况[9-10]。

总之，七氟醚预处理可降低血miR-1含量，减轻CPB期间心肌累积损伤，且在一定浓度范围内七氟醚预处理浓度越高术中及术后6 h血miR-1升高倍数越小。

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Effect on specificm iRNA-1 in pretreatmentw ith sevoflurane for patients accepted the intracardiac surgery under cardiopulmonary bypass

Duan Xiaoxia，Zhang Daiying，Mao Anqiong，Long Xiang，Wang Xiaobin
（DepartmentofAnesthesiology，the Affiliated Hospitalof Luzhou MedicalCollege，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Objective To approach the effectofexpression levelon specificmicroRNA-1（miR-1）in pretreatmentwith sevoflurane forpatientsaccepted the intracardiac surgery undercardiopulmonarybypass（CPB）and analyze the correlation between sevoflurane concentration andmiR-1 level to set forth themechanism of prevention from perioperativemyocardial ischemia injury with sevoflurane further.M ethods A total of 40 patients planned to have intracardiac surgery under CPB from October 2013 to June2014weredivided into twogroups.Group A（20 cases）was treatedwith sevoflurane in advanceand group Bwith routine CPB anesthesia.The blood samples at the time of preoperative 5minutes，during the operation（protamine-against-heparin 5min after the operation）and postoperative 6 hourswere collected by the two groups.It isadopted real-time fluoresence quantitative polymerase chain reaction to testserum miR-1 contentatvarious time.Results The serum miR-1 contents during the operation and 6 h after CPB operation were significantly higher than those before the operation between the two groups.Compare with Group A at the same time，the serum miR-1 content in Group A was lower than thatofgroup B.The difference had statistical significance（P＜0.05）；ThemiR-1 levelsin group A had astrongnegative correlationwith the concentration ofsevoflurane（r=-0.41，-0.81，P＜0.05）.Conclusion Pretreatmentwith sevofluranemay decrease erum miR-1 content，relievemyocardial ischemia injury during the CPB.Under certain scope，the higher the pretreatmentconcentration with sevoflurane the smaller the serum miR-1 contentmultiplerduring the operation and 6 h after theoperation.

Methyethers； Extracorporealcirculation； Myocardialischemia； MicroRNAs； Cardiac surgicalprocedures

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.01.011

A

1009-5519（2015）01-0028-03

2014-08-30）

泸州医学院课题（2013ZRQN082）；泸州医学院附属医院课题（14020）。

段晓霞（1981-），女，四川泸州人，硕士研究生，主治医师，主要从事临床麻醉工作；E-mail：782348971@qq.com。

的影响，分析七氟醚浓度和miR-1表达水平变化的相关性，进一步阐明七氟醚预防围术期心肌缺血损伤的机制。方法

将2013年10月至2014年6月该院胸心外科拟在CPB下行心脏直视手术的40例患者随机分为A、B两组。A组20例行七氟醚预处理；B组20例行常规CPB麻醉。抽取两组患者术前5min、术中（术后鱼精蛋白拮抗肝素后5min）和术后6 h血液标本，采用实时荧光定量聚合酶链反应方法检测不同时间点血miR-1含量。结果 两组患者术中、术后6 h血液标本中miR-1含量明显高于术前，且相应时间点A组患者血miR-1含量低于与B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；七氟醚预处理浓度与术中及术后6 h血miR-1升高的倍数呈负相关 （r=-0.41、-0.81，P＜0.05）。结论 七氟醚预处理可降低血miR-1含量，减轻CPB期间心肌累积损伤，且在一定浓度范围内七氟醚预处理浓度越高，术中及术后6 h血miR-1含量升高倍数越小。