弱后酸化德氏乳杆菌保加利亚亚种生理特性的探究

曹凤波，李媛媛，刘宾，周晶，王晓明，霍贵成

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室食品安全与营养协同创新中心，哈尔滨150030）

0 引言

酸奶因其良好的风味和诸多益生作用而成为最受消费者喜爱的发酵乳制品之一[1]。目前就乳酸菌的生化反应和生理特性做了大量研究，但更侧重于碳代谢，氮代谢等，而菌株在加工处理过程中对环境胁迫的忍受能力也同样需要予以重视[2]。乳酸菌作为单细胞细菌，有较高的体表比，它们对环境变化的适应和灵活反应是生长和代谢的前提[3]。本实验室已筛选出两株低温产酸慢，高温产酸快且发酵性能优良的弱后酸化德氏乳杆菌保加利亚亚种[4-5]，为了探究其生长能力及对环境的适应能力，现对其最适生长温度，耐酸力和耐冷冻能力等进行测定，以更好的培养，优化和制作发酵剂，为今后的试验和生产做铺垫。

1 实验

1.1 材料与试剂

菌种：从乳品科学教育部重点实验室菌种保藏中心（KLDS-DICC）筛选出的两株弱后酸化德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1.1011、KLDS1.1006[4]和具有优良发酵性能的对照菌KLDS1.9201[6]。

培养基：MRS培养基。

主要试剂：偏磷酸缓冲盐，生理盐水等。

1.2 仪器与设备

Delta320精密pH计，DU-800紫外分光光度计，GL-21M高速冷冻离心机，BCN1360型生物洁净工作台，SPX-150B生化培养箱，HIRAYAMA HVE-50形高压灭菌器等。

1.3 方法

1.3.1 生长性能的测定

将试验菌种与对照菌活化两代后以3%接种于MRS液体培养基中，37 °C培养，分别于0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，36和48 h取样测定菌体浓度。

（1）分光光度法测定菌体浓度。利用DU800紫外分光光度计在波长600 nm下测定不同时间菌液的吸光值，以未接过种的培养液为空白对照。

（2）pH值法测定菌体浓度。利用DELTA320精密pH计测定不同时间的pH值。

（3）平板菌落计数法测定菌体浓度。将0.5 mL菌液加到4.5 mL灭菌的质量分数为0.85%生理盐水中，依次10倍稀释，选取合适的稀释倍数进行涂布，同一稀释度取三个平行，在恒温培养箱中42℃培养72 h，选菌落数分布在30～300之间的平板计菌落数。

1.3.2 菌株最适生长温度的测定

将KLDS1.1006和KLDS1.1011按3%的接种量各接到60支MRS液体培养基试管中。分别在30，33，36，39，42、45℃下的恒温培养箱中培养，每个培养箱中放入20支试管，每株菌各10支。于 6，12，24，36和48 h时从每个培养箱中各取2支，采用平板菌落计数法进行活菌计数并测定pH值。制作各菌不同温度的生长曲线[7]。

1.3.3 耐酸能力的测定

将活化好的 KLDS1.1011，KLDS1.1006，KLDS 1.9201接种于MRS液体培养基中，于37℃下培养16 h后，每个样各取3%的接种量分别接种于pH值为3.0，4.5，5.5，6.5的 MRS 液体培养基中，37 ℃下培养12 h。采用平板菌落计数法计算活菌数[8]。

1.3.4 耐冷冻能力的测定

将活化好的 KLDS1.1011，KLDS1.1006，KLDS 1.9201接种于MRS液体培养基中，在37°C培养16 h，分别取10 mL菌液，6 000 r/min离心20 min，收集的菌体用等体积的PBS缓冲液洗脱，6 000 r/min离心20 min，重复两次。将收集的菌体分散于10 mL脱脂乳培养基中，混匀后分装于安培瓶中冻干。冻干前后分别取样，采用平板菌落计数法测定活菌数。

1.3.5 统计分析

采用SPSS19.0软件对实验数据进行差异显著性分析（P＜0.05），每组重复3次，最终结果表示方式为平均值±标准差。相同字母代表差异性不显著，不同字母代表差异性显著。

2 结果与讨论

2.1 菌株生长性能的分析

在描述菌株生长曲线时，分光光度法简单，快捷，可以较准确体现菌株生长的前三个周期，但是因为测定的是浊度，把死菌及其他悬浮物也估算在内，对衰退期无法估量；菌株的生长速度与菌株的代谢和产酸有直接关系，pH值法通过乳酸菌产酸的变化值可以粗略模拟其生长变化；活菌计数法可以真实反映体系中的活菌数的变化，但操作较为繁琐[9]。本研究结合这三种方法对菌株的生长能力进行测定，可以较全面的反映细菌的生长特性。

图1～图3结果显示，在MRS培养基中培养，随着时间的延长，菌株的活菌数是先增加后减少。试验菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011的生长能力显著低于对 照 菌 株 KLDS1.9201（P＜0.05）。 KLDS1.1006 和KLDS1.1011在12 h左右已经进入稳定期，而KLDS 1.9201继续繁殖，在16 h左右进入稳定期，OD值是其他两株菌的1.5倍，pH值最终稳定在3.8，KLDS1.1006和KLDS1.1011分别是4.2和4.5。在活菌数变化曲线中，KLDS1.9201和KLDS1.1006在24 h以后虽有下降趋势，并不显著（P＞0.05），KLDS1.1011的菌数发生了明显的减少（P＜0.05）。可见三种曲线皆能体现菌株的生长状况。菌株生长能力较低导致了其产酸能力较弱，H+-ATPase活性对调节保加利亚乳杆菌的能量代谢和生长意义重大，因此推测生长较弱的菌株可能是由于它的H+-ATPase较低，很大程度上降低了菌株的底物磷酸化水平，导致ATP的产生量随之减少，对外表现为低生长率和弱产乳酸能力[4]。

图1 菌株OD600值变化曲线

图2 菌株pH值变化曲线

图3 菌株活菌数变化曲线

2.2 菌株最适生长温度的分析

乳酸菌一般都属于嗜温或嗜热类微生物，生长环境多在30～45℃的范围内。为了探究试验菌株最适的生长环境，分别取这个温度范围的梯度变化进行生长曲线绘制。试验发现，随着温度的升高，菌株的生长能力依次上升，当温度大于42℃时活菌数反而下降（见图4和图5）。说明，KLDS1.1011和KLDS1.1006的最适生长温度为42℃。细菌受温度的影响主要因为代谢参与的酶存在着最适温度，在合适的温度下可以加快代谢速度，促进其繁殖，提高生长能力。

图4 KLDS1.1011在不同温度下活菌数的变化曲线

图5 KLDS1.1006在不同温度下活菌数的变化曲线

2.3 菌株耐酸能力的分析

图6为酸胁迫对菌株活力的影响。由图6可以看出，三株保加利亚乳杆菌在pH值为5.5的MRS液体培养基中培养12 h时的活菌数高于其他pH值的培养基，说明该菌种更适宜于在偏酸性环境生长。当pH值降到4.5，也就是酸奶发酵终止的pH值时，活力有所下降，但仍都保持在106cfu/mL以上。pH值为3.5时，活菌数显著下降（P＜0.05），KLDS1.1006、KLDS 1.1011和KLDS1.9201的活菌数减少量分别是pH值6.5的99.67%，99.83%和98.34%，在相同条件下，试验菌株较对照菌KLDS1.9201对酸更为敏感。

在酸性条件下，乳酸菌利用质膜的H+-ATPase将细胞内质子泵出到胞外以提高胞内pH值，使其维持近中性，以保证菌体自身代谢的正常进行。生长力较弱的菌株，在pH降低的情况下，H+-ATPase酶活性不能很快增加，所以不能迅速地将细胞内H+排出体外，以维持细胞内pH的恒定，表现出一定的酸敏感性。可见菌株较弱的生长能力和对酸性环境的较高敏感性，有助于菌株在pH值降到一定值后就不能再继续生长，代谢乳糖产酸，有助于降低酸奶在贮存过程中的后酸化程度，从而使酸奶产品的酸度维持在理想水平[10]。

图6 酸胁迫对菌株活力的影响

2.4 菌株耐冷冻能力的分析

保加利亚乳杆菌作为酸奶发酵剂，在冻干和低温保存时，需要暴露于较低的温度下，其对低温冷冻刺激的适应能力对发酵和储存都有重要的意义[11]。在图7中，三株菌在仅以脱脂乳为保护剂的情况下冻干，活菌数有所下降，但高于106mL-1，达到了FAO/WHO建议食品中活菌数应在106～107g-1以上的要求，其中试验菌KLDS1.1006和KLDS1.1011的存活率分别是38.90%和54.95%，显著高于对照菌株KLDS1.9201（P＜0.05），且KLDS1.1011的抗冷冻能力强于KLDS1.1006。

细菌的环境温度骤降，生理功能遭到严重的破坏，如细胞膜流动性下降，DNA的超螺旋架构发生改变，以及DNA和RNA稳定的二级结构遭到破坏而影响其复制，转录和翻译等。不同菌株对冻干的抵抗力有所不同，由试验结果可知，试验菌株的冷适应性比对照菌株强[3]。

图7 冷冻对菌株活力的影响

3 结论

通过对筛选的两株弱后酸化的保加利亚乳杆菌的生理特性进行测定，以探究其生长能力，最适生长温度，对酸和冷冻的耐受能力，为今后深入的研究打下基础。试验结果表明，试验菌株KLDS1.1011和KLDS1.1006进入稳定期的时间较短，但生长能力弱于对照菌KLDS1.9201，说明生长能力与后酸化存在着密切的关系。这种后酸化能力较弱的菌种作为发酵剂可以有效改善储藏期酸奶过酸味及质构问题，与益生菌共同发酵，因其生长力弱，产酸少，较少的抑制双歧杆菌等的生长，提高其存活率[12]，故存在很大的市场前景。在不同温度下，菌株的生长

能力有所不同，在42℃下达到最大，说明两株菌的最适生长温度为42℃。耐酸性试验表明，对酸较敏感的菌株其后酸化也较弱。对酸性环境敏感，有利于菌株在pH降到一定后不再继续产酸，可有效降低酸奶在储藏过程中的后酸化程度。菌株在剧烈的冷冻条件下能够存活是因为有冷应激蛋白的产生[13]，本研究中，试验菌株抗冷冻的能力强于对照菌，可见其具有优良发酵剂的潜能，有进一步进行研究的价值。

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