产肌酸水解酶基因工程菌的构建*

杨波，王滚，蒋芬，刘冠兰，杨成，段绍斌，蒋云生

（1.南华大学附属第一医院肾内科，湖南 衡阳 421001；2.长沙医学院临床医学系，湖南 长沙 410219；3.中南大学湘雅二医院肾内科，湖南 长沙 410011）

·论著·

产肌酸水解酶基因工程菌的构建*

杨波1，王滚1，蒋芬1，刘冠兰1，杨成2，段绍斌3，蒋云生3

（1.南华大学附属第一医院肾内科，湖南 衡阳 421001；2.长沙医学院临床医学系，湖南 长沙 410219；3.中南大学湘雅二医院肾内科，湖南 长沙 410011）

目的构建肌酸水解酶的重组质粒并转化至大肠杆菌，研究其蛋白的表达及活性。方法①根据Genbank数据库已知的肌酸水解酶（黄杆菌U-188）的基因序列，由上海吉凯生物有限公司进行生物合成，得到肌酸水解酶基因片段b；②根据肌酸酶的基因序列设计引物，聚合酶链反应（PCR）扩增，进行双酶切的回收和纯化，与质粒GV296酶切后进行连接，构建重组质粒GV296-b，分别转化至大肠杆菌DH5a，筛选测序鉴定；③提取重组质粒GV296-b，转入至大肠杆菌BL21（DE3），进行菌液PCR鉴定；④工程菌GV296-b/BL21（DE3），向菌液中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导其蛋白表达，并制备粗酶液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）分析；⑤将工程菌GV296-b/BL21（DE3）于含特定浓度肌酸的培养基中培养24 h，取培养液测定肌酸浓度。结果①成功构建重组质粒GV296-b，将上述重组质粒进行双酶切。电泳显示，目的片段大小约为0.783和1.212 kb，与理论值相符；②重组质粒GV296-b，转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，经IPTG诱导后实现高效表达。工程菌GV296-b/BL21（DE3）表达肌酸酶，具有肌酸酶活性，按基因序列图分析肌酸水解酶403个氨基酸，经SDS-PAGE分析酶蛋白的分子量约为43 kD。结论成功构建的工程菌GV296-b/ BL21（DE3）能高效诱导肌酸酶的表达，具有肌酸酶活性。

肌酸水解酶；基因工程菌；肌酸；肌氨酸

慢性肾功能衰竭（简称慢性肾衰）几乎是所有泌尿系疾病的共同归宿，也可继发于其他全身性疾病，如原发性高血压和糖尿病，后者约有43%并发慢性肾衰。据国际肾脏病协会统计，慢性肾衰的人群发病率约为100～200/100万，美国成年人中慢性肾衰的发病率高达7.6%，而日本的发病率更高达996/100万[1-2]。我国慢性肾脏病的发病率约为10.9%[3]，随着人口老龄化速率逐年加快，慢性肾衰的发病率也随之增加，严重威胁着人们的健康及生命。对于慢性肾衰终末期的治疗，现主要依靠血液透析、腹膜透析和肾脏移植进行肾脏替代治疗。目前，对肾脏替代前期治疗采用非透析治疗，其经典方法是胃肠道吸附剂，如氧化淀粉及活性碳制剂。消化道酶疗法的基本方法是采用微胶囊包裹尿素酶及吸附剂，使肌酐、尿素等及其他毒素物质进入微胶囊内得到吸附分解。同时兴起的是肠道细菌疗法，最初选用自然菌种，如肠道菌和低毒土壤菌，制成活菌制剂摄入消化道，分泌分解酶降解肠道内尿毒素。但上述自然菌存在产酶特性不稳定及菌的安全性问题，以致人们致力于基因工程菌的研究。肌酐在肌酐酶催化下生成肌酸，后者在肌酸酶催化下，降解为肌氨酸。本实验将肌酸酶的基因转入特定细菌中，再将这含有某种酶的特定菌种制成生物制剂，摄入肾衰患者的消化道，将患者肠道中的肌酸（由肌酐酶催化肌酐生成）降解为肌氨酸。肌氨酸不但无毒，而且为营养物质，从而达到治疗的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5a（E.coliDH5a）、E.coliBL21（DE3）为南华大学微生物实验室保存，质粒PET28a（+）（GV296），构于上海吉凯生物有限公司，DNA限制性内切酶为美国Biolabs公司生产，T4 DNA Ligase为美国Thermo公司生产，2×Taq Master Mix为北京康为世纪生物科技有限公司生产，高纯度质粒小提试剂盒及DNA凝胶回收试剂盒为北京天根生化科技有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 肌酸酶目的基因片段的构建根据Genbank数据库已知的肌酸酶（黄杆菌U-188）D14464.1的基因序列，由上海吉凯生物有限公司进行生物合成，得到肌酸酶目的基因模板b。

1.2.2 聚合酶链反应（polymease chain reaction，PCR）扩增根据黄杆菌肌酸水解酶的基因序列设计引物，在正向引物中添加酶切位点BamHⅠ，在反向引物中添加酶切位点XhoⅠ，以便以后的克隆和表达。引物设计为正向引物：AGCAAATGGGTCGC GGATCCATGCAAATGCCCAAAACAC；反向引物：T GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTTGCGGATGATG TTTC。反应体系（25μl）：模板b 1μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，2×Taq Master Mix 12.5μl，ddH2O 10.5μl，总体积为25μl。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸80s，共30个循环，72℃继续延伸7 min。反应结束后4℃保存。

1.2.3 PCR产物及质粒的酶切用BamHⅠ和XhoⅠ对PCR产物和GV296进行双酶切。酶切体系（50μl）：DNA 10μl，BamHⅠ1μl，XhoⅠ1μl，Cursmart Buffer 5μl，ddH2O 33μl。37℃反应3 h，65℃灭活10min。

1.2.4 酶切产物电泳并割胶回收肌酸酶目的基因片段的PCR产物及质粒GV296双酶切后，用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA片段。

1.2.5 肌酸酶基因片段b与质粒GV296的连接回收纯化的肌酸酶DNA片段b及质粒GV296酶切回收片段，按照1∶5加样进行连接反应。T4连接酶反应体系（20μl）：T4连接酶1μl，10×连接Buffer 2μl，回收纯化的肌酸酶DNA片段5μl，质粒GV296酶切回收产物1μl，ddH2O 11μl。22℃反应10 min，65℃灭活10 min。重组质粒GV296-b转化E.coli感受态细胞。

1.2.6 转化子挑选与鉴定重组质粒GV296-b转化子使用菌落PCR、双酶切及DNA测序筛选阳性克隆菌。先用菌落PCR初步筛选阳性克隆，然后抽提重组质粒，进行双酶切和DNA测序确定。①菌落PCR：在无菌条件下用接种环在平板上挑取单菌落（选取直径＞1 mm的菌落），分别挑取1个单菌落于1 ml卡那霉素抗性LB培养基离心管中培养，共培养8管，37℃、220 r/min振荡2 h。以通用引物T7 Promoter Primer作为PCR及测序引物。T7引物序列的正向引物：GCTGGAGCGTACCCTGTTC；反向引物：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG。反应体系（12.5μl）：菌液1.5μl，T7正向引物0.25μl，T7反向引物0.25 μl，2×Taq Master Mix 6.25μl，ddH2O 4.25μl，总体积12.5μl。反应条件为：94℃预变性10 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸80 s，共30个循环，72℃继续延伸7 min。PCR反应结束后，置入4℃冰箱保存。将PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，初步筛选阳性克隆菌。②重组质粒GV296-b双酶切及测序：取10μl菌落PCR筛选到的阳性克隆菌液接种于4 ml卡那霉素抗性LB培养基中培养，37℃、220 r/min振荡培养过夜（约12 h）。用质粒提取盒抽提质粒，进行双酶切。将菌落PCR及酶切均显示为阳性的重组质粒GV296-b转化子菌液，送至上海生工生物有限公司测序。

1.2.7 重组质粒GV296-b的鉴定及诱导表达测序正确的阳性转化子GV296-b，提取质粒后，转入至大肠杆菌BL21（DE3），进行转化及菌液PCR，构建表达工程菌GV296-b/BL21（DE3）。根据测序比对正确的肌酸酶序列设计引物，在引物中分别添加酶切位点HindⅢ和XbaⅠ。引物序列为：正向引物CCCAAGCTT-CAGCTGTTGCGCCAGAC；反向引物：GCTCTAGA-GTGGCACGGAGGTTCG。PCR反应结束后，产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆菌。采用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导PCR鉴定阳性的表达工程菌GV296-b/BL21（DE3）蛋白的表达。细菌超声波粉碎后，采用非连续变性电泳，12%浓度的分离胶，5%浓度的浓缩胶。

1.2.8 表达工程菌分解肌酸的体外实验从平板上挑取重组菌GV296-b/BL21（DE3）的单菌落接种于2 ml卡那霉素抗性LB培养基中，37℃、220 r/min揺菌培养过夜。次日按1∶100转种于5 ml卡那霉素抗性LB培养基中，30℃、220r/min培养2h。无菌条件下加入IPTG至终浓度1 mmol，继续培养4 h，收集菌体，先用生理盐水洗涤，再用生理盐水重悬菌体，并用麦氏比浊法调整悬菌液约为1.5×108cfu/ml。取200μl悬菌液加入800μl含特定浓度肌酸的LB培养基中培养，取200μl大肠杆菌DH5a（菌浓度同上）悬菌液，加入800μl含特定浓度肌酸的LB培养基，作为对照组。37℃、220 r/min培养24 h，13 000 r/min离心2 min，取上清液用生化分析仪检测肌酸浓度。取200μl生理盐水加入上述培养基中作为对照组，培养24 h后，同样离心取上清液测肌酸浓度。每组设5个样本。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析（one-way，ANOVA），多重比较用最小显著法（LSD），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增的肌酸酶目的基因

根据Genbank数据库已知的肌酸水解酶（黄杆菌U-188）基因序列，由上海吉凯公司进行生物合成模板b，设计引物，进行PCR扩增，可得到大小约1 252bp的片段，与预期大小一致。见图1。

图1 肌酸酶基因PCR产物电泳图

2.2 PCR鉴定重组质粒GV296-b

重组质粒GV296-b转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取转化子1～8号，进行菌液PCR，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳。泳道5～12为1～8号转化子，经PCR鉴定得到大小约529 bp的片段，与肌酸酶的基因大小相符（见图2）。将PCR鉴定阳性的产物送测序公司测序，证实肌酸酶的基因片段与Genbank报道的基因序列一致（见图3）。

图2 重组质粒GV296-b的菌落PCR测定

2.3 表达工程菌GV296-b/BL21（DE3）的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分析

表达工程菌GV296-b/BL21（DE3）经IPTG诱导表达，终浓度为1.0 mmol，30℃、200 r/min离心4 h后，4℃、13 000 r/min离心1 min，收集沉淀。用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤菌体，超声碎菌体，离心收集上清液和沉淀。分别加入4×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）上样缓冲液，100℃、煮沸10 min，用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）上样，凝胶成像照相。泳道2、4分别为诱导的1、2管沉淀；泳道3、5分别为诱导的1、2管上清液；泳道6、8为未诱导的1、2管沉淀；泳道7、9为未诱导的1、2管上清液。分析可见泳道3、5有目的蛋白表达，分子量约为43 kD，与预期相符合（见图4）。

2.4 表达工程菌分解肌酸活性的测定

表达工程菌GV296-b/BL21（DE3）经IPTG诱导后，取菌液与特定浓度的肌酸作用24 h。作用后表达工程菌组上清液肌酸浓度为（403.4±16.4）μmol/L，与对照组比较[（555.6±11.9）μmol/L]显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；DH5a组为（548.7± 13.5）μmol/L，与阴对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 肌酸酶基因片段的测序图

图4 重组肌酸酶诱导表达的SDS-PAGE分析

3 讨论

在慢性肾衰状态下，机体发生氧化应激反应也相对增加，活性氧和氢氧基及其他自由基生成增多，肌酐与其作用生成氢氧化肌酐，后者在各种酶的作用下最后生成甲基胍[4]。甲基胍升高是引起恶心、呕吐、腹泻、贫血、糖耐量降低、血浆纤维蛋白增高及裂解活性下降、钙吸收减少、胃十二指肠溃疡和出血、抽搐和意识障碍等的主要原因，还可引起胰腺等分泌减少、红细胞自溶，并且对淋巴细胞的DNA合成有抑制作用，同时抑制去甲肾上腺素在交感神经突触小泡中运输。以前有学者将肌酐水解酶克隆入肠道益生菌，使肌酐在肠道内降解成肌酸[5]。然而肌酐经肌酐水解酶生成的肌酸，可通过肝肠循环，经肠道进一步重吸收进入血液，在体内再次代谢转化成肌酐，并未解决根本问题。肌酐在肌酐水解酶的作用下生成肌酸，肌酸在肌酸水解酶作用下进一步生成肌氨酸和尿素。本实验室早期成功构建了肌酐水解酶基因重组工程菌，此次构建含肌酸水解酶的重组菌，表达肌酸水解酶，旨在将肌酐降解肌酸后，进一步降解为肌氨酸。

本实验中，根据Genbank黄杆菌U-188的基因序列进行生物合成肌酸酶目的基因模板，PCR扩增分别得到大小约1.252 kb的肌酸酶目的基因片段。将上述扩增目的片段与质粒GV296连接后，经测序鉴定扩增片段的基因与已知Genbank上的基因完全一致。通过测序比对得到肌酸酶的基因片段大小约为1.212 kb，经酶切后同样证实为肌酸酶的基因片段，显示该基因克隆成功。实验中使用的质粒PET-28a（+）是带有T7 lac启动子的载体，其T7启动子下游有一段lac阻遏蛋白（lacI）操纵子序列编码表达lacI。lacI可以作用于宿主染色体上T7RNA聚合酶前的lacUV5启动子并抑制其表达，也作用于载体T7 lac启动子，以阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录，IPTG通过与lacI结合而保持lac操纵子转录开放。实验结果显示，工程菌有肌酸酶蛋白的表达，并且具有分解肌酸活性。

肠道细菌疗法中极其重要地是选择高效低毒菌，因为外来菌摄入消化道后，可能引起宿主肠道微生态改变，出现新的菌群失调；同时其还可能携带某些耐抗菌素的质粒，这些质粒可能会转入到其他肠道菌种中，导致耐抗生素细菌的感染，对原本免疫力低下的尿毒症患者产生严重的感染性疾病。大肠杆菌是人和动物肠道中的正常栖居菌，其虽然为条件致病菌，但大部分血清型大肠杆菌为人体正常菌群，无异位的大肠杆菌没有致病性。PRAKASH等[6]研究表明，微囊化的基因修饰大肠杆菌DH5a对动物（老鼠）无致病性。大肠杆菌与代谢有关的酶种类很多，这些酶的产生与外环境息息相关。对于尿毒症患者来说，许多代谢废物不能充分经肾脏排泄而蓄积于体内，大量的代谢废物通过丰富的肠壁血管进入肠道，使肠腔内呈高代谢废物水平状态，为细菌的生长繁殖提供丰富的营养及充足的条件从而诱导细菌生长；同时这种环境也能诱导大肠杆菌产生多种酶降解肌酐、尿素氮和尿酸。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统，其不仅具有遗传背景清楚、操作简便、容易培养，还具有能快速大规模地生产目的蛋白的优点[7]。其表达外源基因产物的水平远远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白甚至超过细菌总蛋白量的30%，使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株。

至今为止，基因工程菌宿主菌主要为大肠杆菌，然而大肠杆菌为条件致病菌，存在一个潜在性的问题。大肠杆菌是活菌，摄入消化道后在肠道繁殖，扰乱肠道微生态，使肠道菌群比例改变，造成细菌及毒素移位，导致慢性肾衰微炎症改变[8]。因此考虑下一步采用益生菌做为基因工程菌的宿主菌，有望为慢性肾衰肠道细菌的治疗解决安全性问题。近20年来，人们逐渐致力于乳酸杆菌的生物学性状和基因组学的研究，并且通过基因工程的方法，对其进行遗传修饰，开发构建一系列乳酸杆菌基因表达系统，将其作为基因工程菌用于疫苗研制。本实验成功构建肌酸水解酶的重组质粒菌，为下一阶段构建含有肌酸水解酶的乳酸杆菌基因工程菌奠定基础。作为毒素的肌酐，在转化为肌酸后，进一步转化为营养物质（肌氨酸），为延缓肾功能衰竭及针对慢性肾衰的治疗提供新的思路及治疗方法。

[1]CHEN W,CHEN W,WANG H,et al.Prevalence and risk factors associated with chronic kidney disease in an adult population from southern China[J].Nephrology Dialysis Transplantation, 2009,24(4):1205-1212.

[2]陈孝文,梁东.慢性肾衰竭[M].北京:中国医药科技出版社,2006: 486-488.

[3]ZHANG L,WANG F,WANG L,et al.Prevalence of chronic kidney disease in China:a cross-sectional survey[J].The Lancet, 2012,379(9818):815-822.

[4]车文体,董力,邹贵勉.结肠透析联合药用活性炭对慢性肾功能衰竭患者钙磷和尿酸的吸附作用[J].国际移植与血液净化杂志,2012, 10(6):23-25.

[5]程新,张彦新,周桂凤,等.产肌酐水解酶基因工程菌的构建[J].生物医学工程研究,2009,28(4):299-302.

[6]PRAKASH S,CHANG TM.Growth and survival of renal failure rats that received oral microencapsulated genetically engineered E.coliDH5 cells for urea removal[J].Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol,1998,26(1):35-51

[7]NUC P,NUC K.Recombinant protein production in escherichia eoli[J].Postepy Biochem,2006,52(4):448-456.

[8]WANG F,ZHANG P,JIANG H,et al.Gut bacterial translocation contributes to microinflammation in experimental uremia[J]. Dig Dis Sci,2012,57(11):2856-2862.

（申海菊 编辑）

Construction of creatinase gene engineering bacteria*

Bo YANG1,Gun WANG1,Fen JIANG1,Guang-lan LIU1,Cheng YANG2, Shao-bin DUANG3,Yun-sheng JIANG3
(1.Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital,University of South China, Hengyang,Hunan 421001,P.R.China;2.Clinical Department,Changsha Medical College, Changsha,Hunan 410219,P.R.China;3.Department of Nephrology,the Second Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410011,P.R.China)

【Objective】To construct a plasmid containing creatinase gene,transform it intoEscherichia coliand study its expression and enzyme activity.【Methods】The creatinase(Flavobacterium sp.U-188)gene sequence was biosynthesized according to the GenBank database to get the gene fragment of creatinase b.The primers of creatinase were designed according to the gene sequence.The gene was amplified by PCR.Then the DNA was extracted after double enzyme digestion and purified.The purified DNA was cloned to GV296 to construct the recombinant plasmid GV296-b,which were transformed intoE.coliDH5a for screening and identification.The recombinant plasmid GV296-b was extracted and transformed toE.coliBL21(DE3)for PCR identification of bacterial liquid.The inducer isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside(IPTG)was added into the engineering strain GV296-b/BL21(DE3)to induce protein expression,and SDS-PAGE was conducted. The GV296-b/BL21(DE3)was cultured in the culture medium at a particular concentration of creatinine acid for 24 hours,and then the concentration of creatinine acid in the culture fluid was determined.【Results】①The recombinant plasmid GV296-b was successfully constructed and double digested.Electrophoresis showedthe two restriction enzyme fragments were 0.783 kb and 1.212 kb which were consistent with the theoretical values.②The reconstructed plasmid GV296-b was transformed intoE.coliBL21(DE3)competent cells.The bacterium was induced by IPTG and achieved efficient expression.The bacterium GV296-b/BL21(DE3)expressed active creatinase which was composed of 403 AA in gene sequence mapping with the molecular weight of approximate 43 kD by SDS-PAGE.【Conclusions】The engineering strain GV296-b/BL21(DE3)has been successfully constructed,and the expression of the active creatinase has been efficiently induced.

creatinase；gene engineering bacteria；creatine；sarcosine

Q814

A

1005-8982（2015）29-0012-06

2015-06-16

湖南省自然科学基金（No：13JJ3082）