双合汤对酒精性股骨头坏死兔微循环的影响*

刘华，魏爱淳，秦广珍，陈清清，周永进

（江苏省海安县中医院骨伤科，江苏 海安 226600）

·论著·

双合汤对酒精性股骨头坏死兔微循环的影响*

刘华，魏爱淳，秦广珍，陈清清，周永进

（江苏省海安县中医院骨伤科，江苏 海安 226600）

目的观察双合汤对酒精性股骨头坏死（AOFH）兔微循环的影响。方法将60只中国白兔随机分成正常组、模型组、美多巴组及双合汤低、中、高剂量组。除正常组外，各组给予中国白酒（乙醇含量56%）10 ml/（kg·d）灌胃。在造模同时，各给药组灌胃给药，正常组、模型组给予生理盐水。预防性灌胃给药8周后测定血浆一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）、血清超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）水平。采血后处死实验动物，观察组织病理学的变化。结果与正常组比较，模型组的NO、SOD水平显著下降（P＜0.01），ET-1、MDA水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，双合汤中、高剂量组可显著降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平（P＜0.01）。双合汤中、高剂量组的NO、ET-1、SOD、MDA水平与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组的空骨陷窝率显著高于正常组（P＜0.01），软骨下区血管计数显著低于正常组（P＜0.01）。双合汤中、高剂量组的空骨陷窝率明显低于模型组（P＜0.01），软骨下区血管计数明显高于模型组（P＜0.01）。双合汤中、高剂量组的空骨陷窝率、软骨下区血管计数与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论双合汤能有效改善AOFH兔微循环，从而防治AOFH。

酒精性股骨头坏死；双合汤；微循环；一氧化氮；内皮素-1；自由基

酒精性股骨头坏死（alcohol-inducedosteonecrosis of the femoral head，AOFH）是导致非创伤性股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）最为常见的因素之一，是由乙醇摄入过量导致[1]。AOFH的西医治疗主要以人工全髋关节置换术为主。由于AOFH患者大部分为青壮年，而人工关节的使用寿命有限[2]，患者日后面临多次翻修术的可能。虽然ONFH确切的发病机制尚未完全阐明，但普遍认为其病理基础为骨内微循环障碍。祖国医学以痰瘀同治为非创伤性ONFH的基本治则，在缓解疼痛和改善功能方面，取得较为满意的疗效[3]。双合汤出自清代名医沈金鳌所著《杂病源流犀浊》，笔者将其应用于AOFH的临床治疗多年，收益患者较多。本实验通过观察双合汤对AOFH兔微循环的影响，探讨双合汤对AOFH的治疗作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

健康成年中国白兔60只，平均体重（2.5±0.3）kg，雌雄各半，由南通大学实验动物中心提供，许可证编号：SYXK（苏）2012-0031。美多巴（0.25g/片）由上海罗氏制药有限公司提供，中国白酒（乙醇含量56%）由北京红星股份有限公司提供。

双合汤由本院中药房提供，其处方为：桃仁6 g、当归9 g、白芍9 g、川穹9 g、红花6 g、陈皮9 g、半夏9 g、茯苓9 g、白芥子9 g、生地黄9 g、生姜6 g、甘草6 g及竹沥30 g，将药物加水浸没180 min后煎煮2次，第1次加8倍的水煎煮90 min，滤取煎液，药渣加6倍量的水煎煮60 min，2次煎液合并，减压浓缩至每毫升药液相当于1～2 g生药，备用。一氧化氮（nitric oxide，NO）、内皮素-1（endothelin-1，ET-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒购自上海奥斯生物试剂公司，TDL80-2B台式离心机购自上海安亭科学仪器有限公司，分光光度计购自上海强申生化仪器厂，γ放射免疫计数器购自科大创新股份有限公司，光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 动物分组

按随机数字表法，将中国白兔分成6组，即正常组、模型组、美多巴组、双合汤低剂量组、双合汤中剂量组及双合汤高剂量组，每组10只。

1.3 AOFH动物造模及给药

参照刘忠堂等[4]方法进行造模，所有动物饲养于南通大学实验动物中心，每组兔在同样条件下单独分笼饲养，自由饮食，温度、换气、照明等饲养环境控制在规定范围内，饲养1周适应环境后开始实验，采用灌胃法，除正常组外其余各组给予同种中国白酒10 ml/（kg·d）灌胃。采用白酒灌胃同时，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予50、100和50 ml双合汤灌胃，每日早晚各1次；美多巴组给予0.125 g美多巴灌胃，每日早晚各1次；正常组、模型组以100 ml生理盐水灌胃，每日早晚各1次。

1.4 微循环指标的测定

兔给药8周后，禁食12 h，在兔耳中心静脉取血10 ml，以3 500 r/min离心20 min，分离出血浆、血清。然后采用硝酸还原酶法测定血浆NO水平；采用放射免疫法测定血浆ET-1水平；采用黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD水平；采用硫代巴比妥酸比色法测定过氧化脂质（lipid peroxides，LPO）代谢物，即血清MDA水平代表LPO的水平。以上操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 组织形态学观察

采血后，以空气栓塞法处死实验动物，取双侧股骨头沿冠状面切开，10%福尔马林溶液固定，5%稀硝酸脱钙，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，显微镜下观察骨细胞、骨髓脂肪细胞及骨小梁结构。骨细胞坏死病理变化以空骨陷窝率表示，即在高倍镜下，随机选10个视野，在每个视野中记数50个骨陷窝，数出其中的空骨陷窝数，然后计算空骨陷窝占50个骨陷窝数的百分比。在中倍镜下，任选10个视野，通过墨染程度，进行软骨下区血管计数。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组NO、ET-1、SOD、MDA水平比较

模型组的NO、SOD显著低于正常组（P＜0.01）；模型组的ET-1、MDA显著高于正常组（P＜0.01）。与模型组比较，双合汤低剂量组和美多巴组可降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平（P＜0.05）。与模型组比较，双合汤中、高剂量组可显著降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平（P＜0.01）。双合汤中、高剂量组的NO、ET-1、SOD、MDA与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组NO、ET-1、SOD、MDA水平比较（±s）

表1 各组NO、ET-1、SOD、MDA水平比较（±s）

注：1）与正常组比较，P＜0.01；2）与模型组比较，P＜0.05；3）与模型组比较，P＜0.01

组别NO/（μmol/L）ET-1/（pg/ml）SOD/（u/ml）MDA/（nmol/L）正常组24.49±5.8713.32±3.95243.5±29.922.73±0.43模型组13.14±4.061）25.68±5.981）139.4±21.571）4.96±0.711）美多巴组20.53±4.952）19.39±4.822）203.7±24.632）3.78±0.592）低剂量组19.98±4.892）20.13±4.872）201.8±24.282）3.81±0.612）中剂量组23.68±5.693）14.01±3.983）240.9±29.693）2.86±0.473）高剂量组23.84±5.773）13.64±4.033）241.3±29.743）2.81±0.453）

2.2 组织形态学观察

2.2.1 模型组骨小梁内残留少数正常骨细胞，骨细胞空骨陷窝多见；软骨下骨髓区见大片骨髓组织明显脂肪变性、坏死，髓内血管的管腔变狭窄，其内见较多血栓与脂肪栓子。见图1。

图1 模型组（HE×100）

2.2.2 美多巴组骨小梁内残留的正常骨细胞占一半，可见骨细胞空骨陷窝；软骨下骨髓区见部分骨髓组织脂肪变性、坏死，部分髓内血管的管腔变狭窄，其血栓与脂肪栓子比模型组减少。低剂量组与美多巴组类似。见图2。

图2 低剂量组（HE×100）

2.2.3 中剂量组骨小梁内残留的正常骨细胞占大部分，可见少许骨细胞空骨陷窝；软骨下骨髓区见少许骨髓组织脂肪变性、坏死，少许髓内血管的管腔变狭窄，少许血栓与脂肪栓子形成。见图3。

图3 中剂量组（HE×100）

2.2.4 高剂量组骨小梁内的正常骨细胞占绝大部分，可见少许骨细胞空骨陷窝；软骨下骨髓区见少许骨髓组织脂肪变性、坏死，少许髓内血管的管腔变狭窄，但未见明显血栓与脂肪栓子形成。见图4。

2.2.5 正常组表现为完整结构的正常股骨头组织。见图5。

2.3 各组空骨陷窝率、软骨下区血管计数比较

模型组空骨陷窝率显著高于正常组（P＜0.01）；模型组软骨下区血管计数显著低于正常组（P＜0.01）。双合汤低剂量组与美多巴组空骨陷窝率低于模型组（P＜0.05）；双合汤低剂量组与美多巴组软骨下区血管计数高于模型组（P＜0.05）。双合汤中、高剂量组空骨陷窝率明显低于模型组（P＜0.01）；双合汤中、高剂量组软骨下区血管计数明显高于模型组（P＜0.01）。双合汤中、高剂量组空骨陷窝率、软骨下区血管计数与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图4 高剂量组（HE×100）

图5 正常组（HE×100）

表2 各组空骨陷窝率、软骨下区血管计数比较（±s）

表2 各组空骨陷窝率、软骨下区血管计数比较（±s）

注：1）与正常组比较，P＜0.01；2）与模型组比较，P＜0.05；3）与模型组比较，P＜0.01

组别空骨陷窝率/%软骨下区血管计数/例正常组10.63±3.259.00±2.45模型组23.94±6.311）5.50±1.861）美多巴组16.86±4.832）7.20±2.1 72）低剂量组17.04±4.912）7.15±2.1 22）中剂量组11.1 9±3.483）8.79±2.383）高剂量组11.01±3.373）8.86±2.413）

3 讨论

长期酗酒成为ONFH最为常见的因素之一，酒精中毒是AOFH一个确定的病因[5]，但AOFH确切的发病机理尚未完全阐明。近年来提出多种学说，如脂质代谢紊乱与酒精的细胞毒作用学说、脂肪栓塞与局部血管内凝血学说、骨髓基质细胞成脂分化学说、骨细胞脂肪变性等。但学者普遍认为骨内微循环障碍为ONFH的病理基础，而微血管损伤则是导致骨内微循环障碍的最重要因素[6]。在本实验中，笔者发现模型组中股骨头出现片状墨汁缺乏现象，提示在AOFH过程中，血管损伤是一个极为重要的环节。

NO为血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）释放最为重要的血管舒张因子，其减少是血管内皮功能失调的主要表现，ET-1是与NO生理作用相拮抗的生物活性物质。在VEC中，NO由NO合成酶催化L-精氨酸生成，NO是细胞间信息传递的主要调节因子，NO可使血管平滑肌内的鸟苷酸环化酶激活，环磷酸鸟苷浓度升高，游离Ca2+浓度降低，使血管平滑肌松弛，血管舒张。ET-1是ET家族3种异构体之一，分布在VEC中的ET-1是ET家族中发挥生物学效应最主要的形式。ET-1与血管平滑肌细胞表达的内皮素A型受体结合可收缩血管，ET-1是至今为止最强烈的血管收缩肽，其收缩血管效应最持久。正常生理条件下，ET-1与NO保持相对动态平衡，共同维持血管的正常压力与血液的良好流动状态。但在病理条件下，VEC功能受损时，NO释放减少、ET-1释放增多，两者原有的动态平衡失调，导致血管内皮损伤[7]，这些改变发生于股骨头及其滋养血管，导致股骨头内微循环障碍，发生ONFH[8]。本研究结果显示，模型组的NO水平显著低于正常组，而ET-1水平显著高于正常组，这与齐振熙等[8]的研究结果一致。另外，模型组中可见髓内血管的管腔变狭窄，其内有较多血栓与脂肪栓子，说明AOFH中存在微循环障碍。齐振熙等[8]认为长期酗酒可引起血液中ET-1水平升高，使血管强烈收缩，但静脉的收缩作用明显强于动脉，致使股骨头内形成高灌低排的状态，髓内血液淤积，微血管内栓塞较易形成。此外，ET-1还可引起血管平滑肌收缩，导致血管腔变狭窄，血栓更易形成；血液中NO水平的减少使血管舒张功能下降，致使股骨头内微血管灌注不足，最终引起股骨头内供血不足。

本研究结果还显示，模型组的SOD水平显著低于正常组，而MDA水平显著高于正常组，这与MEYE等[9]研究的结果相似，说明AOFH中存在氧自由基代谢异常。SOD为机体防御内、外环境中超氧离子损伤的主要酶，能清除机体内氧自由基，具有保护生物膜与血红蛋白免受损伤的作用。LPO为氧自由基与细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧反应的产物，重要损伤部位是亚细胞器与细胞膜，能破坏生物膜，增加血小板的聚集性。LPO是反应自由基对机体损伤的指标。MDA是LPO的最终产物，其在组织中的水平可直接反应机体脂质过氧反应程度。正常生理条件下，自由基的产生与清除保持平衡，长期酗酒可引起氧自由基代谢异常，股骨头局部SOD活性降低，LPO水平增加，过多的自由基损伤毛细血管壁，不仅可引起血管内凝血、血栓形成，导致骨内微循环障碍，还可增加骨髓内水肿，导致缺血程度加重。同时，血小板与白细胞积聚并产生自由基，可诱发组织释放组织胺，组织胺作用于微血管上皮细胞，增强毛细血管的通透性，使骨内微循环障碍，导致股骨头缺血性坏死[8]。MEYE等[9]认为酒精毒性作用使自由基生成增多，导致自由基的主要清除剂——SOD活性降低，LPO反应增强，通过影响细胞膜的通透性引起VEC损伤，小动脉发生纤维变性与粥样硬化，血供不足，最终导致股骨头血运障碍而发生坏死。

黄立新等[10]应用美多巴治疗早期AOFH，随访27.8个月，患者临床症状、X线与MRI表现有明显改善。吕智等[11]的动物实验研究显示，美多巴能使血浆内生长激素明显升高，促进坏死股骨头内的新骨形成，从而增强坏死股骨头的力学性能。本实验亦选用美多巴作为对照药物。在临床中，笔者将ONFH辨证分型为气滞血瘀型、痰瘀痹阻型及肝肾亏虚型，AOFH归属于痰瘀痹阻型，嗜酒无度损伤脾胃，导致脾失健运，肝失疏泄，湿热内蕴，痰浊郁结，瘀血阻滞。刘道兵等[3]经过多年的研究提出脾虚生痰，由痰致瘀，因瘀致痹的非创伤性ONFH学说，以及健脾化痰与活血通络的痰瘀同治基本原则。

双合汤有活血化瘀、祛痰通络的作用，方中桃仁、红花、当归、川穹有活血化瘀、通络止痛的作用，半夏、茯苓、白芥子、鲜竹沥、陈皮有祛痰的作用，白芍有酸敛肝阴的作用，生地有黄养肝阴而泄伏热的作用，生姜汁、甘草有温中健脾、调和诸药的作用，笔者根据酒精导致ONFH的病因特点，认为痰瘀痹阻正是早中期AOFH的发病机制，故在临床上，使用双合汤加减治疗塌陷前期AOFH，并获得较理想疗效。

其实双合汤是以桃红四物汤与二陈汤合并，并配以白芥子、竹沥祛痰组成。现代药理研究证实，桃红四物汤具有保护血管内皮细胞与改善血管内皮细胞的分泌功能，通过改善血液流变学而降低血脂[12]；徐世红等[13]的研究表明，桃红四物汤具有促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨性分化活性的作用；二陈汤能有效调节脂质代谢紊乱[14]。

本研究结果显示，与模型组比较，双合汤中、高剂量组可显著降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平；中剂量组中见少许髓内血管管腔变狭窄，其内少许血栓与脂肪栓子形成，而高剂量组中未见髓内血管内明显血栓与脂肪栓子形成；双合汤中、高剂量组空骨陷窝率明显低于模型组，软骨下区血管计数明显高于模型组，提示双合汤能缓解酒精引起的VEC损害，恢复NO与ET-1、氧自由基代谢平衡，改善股骨头局部的微循环，从而起防治AOFH的作用。

[1]MUTIJIMA E,DE MAERTELAER V,DEPREZ M,et al.The apoptosisofosteoblastsandosteocytesinfemoralheadosteonecrosis:its specificity and its distribution[J].Clin Rheumatol, 2014,33(12):1791-1795.

[2]彭吾训,王蕾,邓进,等.BCBB/BMP/bFGF复合物修复股骨头坏死模型的成骨观察[J].中国现代医学杂志,2010,20(19):2917-2921. [3]刘道兵,王荣田,陈卫衡.从痰瘀同病论股骨头坏死的中医药治疗[J].中医杂志,2013,54(19):1644-1646.

[4]刘忠堂,王坤正,池永龙,等.PGE2和TXB2在酒精性股骨头骨坏死中的意义[J].临床骨科杂志,2002,5(2):90-93.

[5]ZALAVRAS CG,LIEBERMAN JR.Osteonecrosis of the femoral head:evaluation and treatment[J].J Am Acad Orthop Surg,2014, 22(7):455-464.

[6]VAISHYA R.Spontaneous fracture of the femoral neck in preexisting avascular necrosis of femoral head in sickle cell disease[J]. Chin J Traumatol,2012,15(5):312-314.

[7]CHATSURIYAWONG S,GOZAL D,KHEIRANDISH GL,et al. Genetic variance in nitric oxide synthase and endothelin genes among children with and without endothelial dysfunction[J].J Transl Med,2013,11(1):226-228.

[8]齐振熙,喻灿明.酒精性股骨头缺血坏死大鼠血浆内皮素与一氧化氮的变化[J].中国临床康复,2005,9(42):90-91.

[9]MEYE C,SCHUMANN J,WAGNER A,et al.Effects of homocysteine on the levels of caveolin-1 and eNOS in caveolae of human coronary artery endothelial cells[J].Atherosclerosis,2007, 190(2):256-263.

[10]黄立新,董天华,谢道海,等.美多巴治疗早期非创伤性股骨头坏死的近期疗效观察[J].中华骨科杂志,2010,30(7):641-645.

[11]吕智,刘小丽,董天华,等.左旋多巴对兔股骨头坏死模型实验修复过程的影响[J].中华骨科杂志,1999,19(6):370-373.

[12]李润生,李大勇,陈文娜,等.桃红四物汤调节血管内皮细胞功能及治疗动脉硬化闭塞症的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2014, 34(2):191-196.

[13]徐世红,谢兴文,李宁,等.桃红四物汤含药血清对骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化的影响[J].中华中医药杂志,2013,28(9):2713-2716.

[14]丁珊珊,张凌媛,康洁,等.二陈汤对高脂饮食大鼠脂质代谢和Caveolin-1表达的影响[J].时珍国医国药,2014,25(9):2060-2062.

（申海菊 编辑）

Effect of Shuanghe Decoction on microcirculation of rabbits with alcohol-induced osteonecrosis of femoral head*

Hua LIU,Ai-chun WEI,Guang-zhen QIN,Qing-qing CHEN,Yong-jin ZHOU
(Department of Orthopedics,Chinese Medicine Hospital of Haian,Haian, Jiangsu 226600,P.R.China)

【Objective】To observe the effect of Shuanghe Decoction on microcirculation of Chinese white rabbits with alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head(AOFH).【Methods】In this study 60 Chinese white rabbits were randomly divided into normal group,model group,Madopar group,and low-,medium-and high-dose Shuanghe Decoction groups.Except the normal group,each group was lavaged with Chinese spirit (alcohol content 56%)10 ml/（kg·d）.Meanwhile each dose group was lavaged with the drug.The normal group and the model group were given normal saline.After 8 weeks the rabbits were sacrificed to collect blood for determination of nitric oxide(NO),endothelin-1(ET-1),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA).The rabbits were killed after collection of blood,and histopathological changes were detected.【Results】Compared with the normal group,the levels of NO and SOD in the model group were significantly decreased(P＜0.01),and the levels of ET-1 and MDA in the model group were significantly increased(P＜0.01).Compared with the model group,the levels of ET-1 and MDA were significantly decreased in the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups,and the levels of NO and SOD were significantly increased(P＜0.01).Differences in the levels of NO,ET-1,SOD and MDA between the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups and the normal group had no statistical significance(P＞0.05).Compared with the normal group,the empty bone lacuna rate in the model group was significantly increased(P＜0.01), and the blood vessel count in hypotegum of cartilage was significantly decreased(P＜0.01).Compared with the model group,the empty bone lacuna rate was significantly decreased in the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups(P＜0.01),and the blood vessel count in hypotegum of cartilage was significantly increased(P＜0.01).Differences of the empty bone lacuna rate and blood vessel count in hypotegum of cartilage between the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups and the normal group had no statistical significance(P＞0.05).【Conclusion】Shuanghe Decoction can effectively improve the microcirculation of rabbits with AOFH,thus prevent and cure AOFH.

alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head；Shuanghe Decoction；microcirculation；nitric oxide；endothelin-1；free radical

R274.9

A

1005-8982（2015）29-0039-05

2015-01-04

江苏省南通市市级科技计划项目（No：HS13933）

魏爱淳，E-mail：jshawac@163.com