C型钠尿肽对百草枯致肺纤维化小鼠Toll样受体4表达的影响

杨晨，赵文静，孟天丽

[1.徐州医学院（江苏省麻醉学重点实验室），江苏 徐州 221004；2.徐州医学院附属医院重症医学科，江苏 徐州 221006]

·论著·

C型钠尿肽对百草枯致肺纤维化小鼠Toll样受体4表达的影响

杨晨1，赵文静2，孟天丽1

[1.徐州医学院（江苏省麻醉学重点实验室），江苏 徐州 221004；2.徐州医学院附属医院重症医学科，江苏 徐州 221006]

目的观察C型钠尿肽（CNP）对百草枯（PQ）诱导的小鼠肺纤维化的保护作用及机制。方法72只雄性昆明小鼠随机分为对照组（D组）、模型组（PQ组）和治疗组（CNP组），每组24只。分别于给药后7、14、21和28 d处死小鼠，收集肺组织，监测小鼠一般情况，Western blot检测肺组织Toll样受体4（TLR4）表达。结果与D组相比，PQ组7、14、21和28 d TLR4表达明显升高，肺损伤严重，差异有统计学意义（P＜0.05）；CNP组各指标无明显变化。结论CNP对PQ诱导的小鼠肺纤维化有保护作用，可能与其抑制TLR4表达有关。

C型钠尿肽；百草枯；肺纤维化；Toll样受体4

百草枯（Paraquat，PQ）是一种非选择性的高效接触性除草剂，对人畜有较强毒性，PQ中毒后可致肺、肾、肝等多脏器功能损伤，肺是主要受损的靶器官[1]。误服或自杀服用PQ导致中毒是临床常见的急危重症，其具体的中毒机制尚未明确，无特效解毒药物，临床病死率高达80%[2]。死亡的首要原因是渐进的不可逆肺纤维化引起进行性呼吸衰竭[3]。C型钠尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）是钠尿肽家族的第3个成员，由血管内皮细胞产生，具有抗炎和抗增殖能力[4]。最新研究表明，Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）活化增加转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)的敏感性，同时导致成纤维细胞增多[5]。本实验通过建立小鼠百草枯中毒致肺纤维化模型，观察肺组织TLR4的激活和表达，旨在从动物实验的角度探讨CNP干预效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品及主要试剂

清洁级雄性昆明小鼠，8～10周龄，体重30～35 g，由徐州医学院实验动物中心提供。百草枯粉剂（上海药物研究所）纯度＞99.4%，CNP（美国Phoenix Biotech公司），TLR4单抗（美国ABCOM公司），其他试剂为国产分析纯试剂。

1.2 动物分组和模型的建立

小鼠室温条件下饲养在鼠笼中，保持湿度。实验前饲养1周，使小鼠适应环境，期间密切观察。实验过程中自由进食、水，用生理盐水配制成药物溶液。按随机数字表法将72只雄性昆明小鼠平均分为3组：①对照组（D组）生理盐水0.1 ml/d；②模型组（PQ组）百草枯（10 mg/kg）0.1 ml/d；③治疗组（CNP组）百草枯（10 mg/kg）0.1ml/d+CNP 3μg/（kg·d）。给药方式：①腹腔注射生理盐水+PQ，3 d/次，共5次；②尾静脉注射CNP，2 d/次，至28 d。各组分别于染毒后7、14、21和28 d处死6只小鼠，打开胸腔，取出完整肺组织。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠一般情况实验期间观察小鼠活动、精神及呼吸等。

1.3.2 肺组织TLR4蛋白测定取肺组织制备匀浆，用Western blot检测蛋白，蛋白样品经电泳、转膜、封闭、加兔抗TLR4多克隆抗体孵育，漂洗，加羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）孵育，再漂洗等步骤后，用化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显色，在成像仪中观察结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间比较用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

D组小鼠活泼好动，精神状态佳，呼吸平稳，毛发色泽光亮洁净，体重增加。PQ组小鼠表现为倦怠嗜睡，活动少，呼吸急促，毛发色泽暗淡，体重增加缓慢，早期体重减轻。与PQ组小鼠比较，CNP组小鼠中毒反应相对较轻。

2.2 肺组织TLR4蛋白含量变化

与D组相比，PQ组TLR4蛋白含量显著升高；CNP组无明显变化。见图1～4。

图1 第7天各组TLR4蛋白含量表达

图2 第14天各组TLR4蛋白含量表达

图3 第21天各组TLR4蛋白含量表达

图4 第28天各组TLR4蛋白含量表达

3 讨论

百草枯又名克芜踪，为联吡啶类化合物。1962年发现以来，被世界各国广泛应用于农业，可经皮肤、呼吸道、消化道吸收造成急性中毒。PQ中毒2 h后，即出现肺纤维化[6]，早期死于急性肺损伤（acute lung injury，ALI）所致的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），晚期死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭[7]。最新研究显示，PQ中毒致肺纤维化是损伤、炎症、修复和肺损伤相互作用的结果。百草枯中毒的发病机制包括两个阶段，初始阶段涉及多个器官急性损伤，可能会出现死亡，并与肺、肾、循环衰竭等有关。这个阶段的存活患者可发展到第二阶段，其特征几乎只损伤肺，广泛的肺纤维化随之而来，导致呼吸困难、紫绀、呼吸衰竭，最终死亡。百草枯中毒后，肺组织中PQ浓度比血浆浓度高10～90倍[8]，主要通过Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞和细支气管膜上多胺运输系统[9-10]的主动摄取而选择性地在肺内聚集，其肺毒性是由一系列氧化还原反应循环及细胞内氧化应激反应所致。

ALI是各种直接或间接因素导致的肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的非心源性的急性低氧性呼吸功能不全。发展至严重阶段（氧合指数＜200）称为ARDS。肺纤维化被定义为一种慢性免疫应答，其特征在于炎症、组织重塑和修复过程。无论任何病因，纤维化疾病都有相似之处，包括一个持久刺激也会导致结缔组织元素的沉积，从而重塑组织的正常结构。成纤维细胞参与机体炎症反应，并同时启动纤维化机制，细胞外基质沉积可以在一定程度上修复急性炎症反应引起的组织损伤，过度的沉积则会引起组织纤维化疾病，并导致一系列结构和功能的改变。PQ诱导的肺纤维化特征是肺血管阻塞、胶原纤维显著增加和成纤维细胞在肺泡积聚[11]，是一种慢性、进行性、不可逆的间质性肺疾病。

CNP最初在猪脑中分离，为22个氨基酸的多肽，结构与心房钠尿肽和脑钠尿肽有关，三者遗传性不同，但都具有利尿和舒血管作用[12]。人类CNP前体分子包括126个氨基酸残基，在种属间大量存在，鼠、猪和人有95%同源性[13]。CNP主要是由血管内皮细胞分泌的具有调节血管活性的多种生物学功能的多肽，其受体广泛分布于血管平滑肌、心肌、肾脏、肾上腺、骨/软骨、神经元等多器官组织，参与调节血管紧张度、组织损伤修复、免疫调节、细胞保护及促进软骨骨化等体内重要脏器的多种生理功能[14]。CNP是钠尿肽受体-B唯一的天然配体，对ALI具有保护作用[15]。

TGF-β1是公认的参与肺纤维化的关键因子[16-17]，诱导胶原合成和基质改变，PQ中毒早期即可检测到TGF-β1表达，并在整个纤维化进展的过程中持续表达。TLRs是一种模式识别受体，广泛表达于细胞表面。TLR4作为已识别的哺乳动物和人类共同拥有的10种Toll样受体之一[18]，能够激活与适应性免疫有关的基因。在多种脏器纤维化中，TGF-β和TLR4表达增加且相互作用[19-22]。有研究报道，TLR4基因失活可明显减弱脓毒症症状，通过改善肺顺应性，阻止肺水肿的形成，改善组织学变化[23]。

目前，国内外文献中未发现有关外源性CNP对PQ中毒致肺纤维化影响的报道。实验结果显示，早期给予CNP干预，可以降低TLR4蛋白的表达，从而减轻肺组织病理损伤，具有一定的保护作用。

[1]佟飞,扈琳,田英平,等.褪黑素对急性百草枯中毒大鼠肺组织核因子-kB诱导型一氧化氮合酶的影响及治疗作用的研究[J].中国现代医学杂志,2006,16(24):3733-3735.

[2]郑福禄,刘宇鹏.老年百草枯中毒患者血清酶学变化及意义[J].中国老年学杂志,2011,31(7):1253-1254.

[3]GE W,WANG HL,SUN RP.Clinical characteristics of paraquat poisoning in 22 Chinese children[J].Indian Journal of Pediatrics, 2013,81(7):670-674.

[4]SCHACHNER T,ZOU Y,OBERHUBER A,et al.Perivascular applicationofC-type natriuretic peptide attenuates neointimal hyperplasia in experimental vein grafts[J].European Journal of Cardio-thoracic Surgery,2004,25(4):585-590.

[5]BHATTACHARYYA S,KELLEY K,MELICHIAN DS,et al. Toll-like receptor 4 signaling augments transforming growth factor-β responses a novel mechanism for maintaining and amplifying fibrosis in scleroderma[J].American Journal of Pathology, 2013,182(1):192-205.

[6]XIE H,WANG R,TANG X,et al.Paraquat-induced pulmonary fibrosis starts at an early stage of inflammation in rats[J].Immunotherapy,2012,4(12):1809-1815.

[7]刘会芳,赵燕燕,魏芳,等.生脉注射液对百草枯中毒大鼠急性肺损伤的保护作用[J].中国现代医学杂志,2009,19(24):3688-3691.

[8]崔晓悦,俞凤.百草枯中毒患者血清黄嘌呤氧化酶及超氧化物歧化酶水平变化及其意义[J].安徽医药,2014,18(9):1737-1740.

[9]SMITH LL,LEWIS CP,WYATT I.The importance of epithelial uptake systems in lung toxicity[J].Environmental Health Perspectives,1990,85:25-30.

[10]钱洁,吕利雄,朱长清.百草枯肺与多胺转运体[J].中国劳动卫生职业杂志,2010,28(7):554-556.

[11]MALEKINEJAD H,MEHRABI M,KHORAMJOUY M,et al. Antifibrotic effect of atorvastatin on paraquat-induced pulmonary fibrosis:role of PPARγ receptor[J].European Journal of Pharmacology,2013,720(1/2/3):294-302.

[12]CHEN HH,BURNETT JC.C-type natriretic peptide:the endothelial component of the natriuretic peptide system[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology,1998,32(3):22-28.

[13]关德明.C型促尿钠多肽研究现状[J].哈尔滨医科大学学报, 2000,5(34):388-390.

[14]LINCOLN RP,SARAH AH,DEBORAH MD.Natriuretic peptides,their receptors and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions[J].Endocrine Reviews,2006,27(1): 47-72.

[15]张剑锋,李超乾,陈雯,等.C型钠尿肽及其受体在急性肺损伤大鼠肺组织的表达变化及其意义[J].蛇志杂志,2010,22(1):5-8.

[16]曾玉兰,冷凡.大蒜素对肺纤维化大鼠肺组织α-SMA和TGF-β1表达的影响[J].中国现代医学杂志,2011,21(15):1814-1818.

[17]彭张哲,朱玉娴,陶立坚,等.卡托普利对博莱霉素致小鼠肺纤维化的防治作用及其机制探索[J].中国现代医学杂志,2010,20(4): 539-543.

[18]YOKOTA S,OKABAYASHI K,YOKOSAWA N,et al.Measles virus P proteinsuppresses Toll-likereceptorsignalthrough up-regulation of ubiquitin-modifying enzyme A20[J].Faseb J, 2008,22(1):74-83.

[19]PULSKENS WP,RAMPANELLI E,TESKE GJ,et al.TLR4 Promotes fibrosis but attenuates tubular damage in progressive renal injury[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(8):1299-1308.

[20]DONG XS,XU XY,SUN YQ,et al.Toll-like receptor 4 is involved in myocardial damage following paraquat poisoning in mice[J].Toxicology,2013,312:115-122.

[21]SEKI E,MINICIS SD,OSTERREICHER CH,et al.TLR4 enhances TGF-β signaling and hepatic fibrosis[J].Nature Medicine, 2007,13(11):1324-1332.

[22]CHEN J,ZENG B,YAO H,et al.The effect of TLR4/7 on the TGF-β-induced smad signal transduction pathway in human keloid[J].Burns,2013,39(3):465-472.

[23]赵双平,邬娇,刘志勇,等.血必净注射液对脓毒症患者外周血TLR4表达的影响[J].中国现代医学杂志,2010,20(4):559-561.

（申海菊 编辑）

Effects of C-type natriuretic peptide on Toll-like receptor 4 expression in mice with Paraquat induced pulmonary fibrosis

Chen YANG1,Wen-jing ZHAO2,Tian-li MENG1
(1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Anesthesiology,Xuzhou Medical College,Xuzhou, Jiangsu 221004,P.R.China;2.Department of Intensive Care Medicine,the Affiliated Hosptial,Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu 221006,P.R.China)

【Objective】To observe that protective effect of C-type natriuretic peptide(CNP)on Paraquat induced pulmonary fibrosis in mice and its mechanism.【Methods】Totally 72 male Kunming mice were randomly divided into three groups with 24 in each group:control group(D group),model group(PQ group)and treatment group(CNP group).The mice were sacrificed 7,14,21 or 28 days after administration of drug and the lung tissue was collected.The general physical condition was observed.The expression of Toll-like receptor 4(TLR4)was measured by Western blot.【Results】At the corresponding time point,the pathological damage of lung tissue in the PQ group was significantly more severe than that in the D group and the level of TLR4 in the lung tissue in the PQ group were significantly higher than that in the D group(P＜0.05). Those in the CNP group showed no significant changes compared to the D group.【Conclusion】The protective effect of CNP on Paraquat induced pulmonary fibrosis may be related to its inhibition of TLR4 expression.

C-type natriuretic peptide；Paraquat；pulmonary fibrosis；Toll-like receptor 4

R563.9；R595.4

A

1005-8982（2015）29-0035-04

2015-03-03

赵文静，E-mail：zhaowj886@sina.com