普罗帕酮对兔心室肌细胞动作电位的影响及对快钠电流的使用依赖性阻滞作用

李晶，郑霄云，周刚，赵籥陶，杨震

基础与实验研究

普罗帕酮对兔心室肌细胞动作电位的影响及对快钠电流的使用依赖性阻滞作用

李晶，郑霄云，周刚，赵籥陶，杨震

目的：探讨普罗帕酮对兔心室肌细胞动作电位（AP）的影响及对快钠电流的张力性阻滞和使用依赖性阻滞作用。

方法：选取10只成年新西兰大白兔，急性分离兔心脏，应用消化酶消化分离获得单个心室肌细胞（n=10），采用微电极技术记录AP的最大舒张期电位、0相最大上升速率（Vmax）、AP振幅，以及复极化20%、50%和90%时的动作电位时程（依次简写为APD20、APD50和APD90）。应用全细胞膜片钳技术检测兔心室肌细胞快钠电流的I-V曲线及不同频率下的峰值电流，并用10 μmol/L普罗帕酮溶液灌流干预，最后进行统计分析。

结果：与普罗帕酮灌流前相比，普罗帕酮灌流后，兔心室肌细胞最大舒张电位无明显变化[（-80±6）mV vs （-82±5）mV，P＞0.05]，AP振幅显著降低[（95±12）mV vs （125±10）mV，P＜0.05]，Vmax明显减慢[（330±43） V/s vs （420±54）V/s，P＜0.05）]，APD20[（8±2）ms vs （6±2）ms，P＞0.05]、APD50[（16±3）ms vs （12±3）ms，P＞0.05]和APD90[（86±14）ms vs （85±12）ms，P＞0.05]无显著变化。普罗帕酮干预后，快钠电流的I-V曲线较干预前明显上移，峰值电流下降[（3 001±383）pA vs （4 193±378）pA，P＜0.05]。分别予0.06、1、2、5、10 Hz频率刺激，普罗帕酮干预前快钠电流均未显示出使用依赖性阻滞作用，第10个刺激与第1个刺激诱发的快钠电流之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。普罗帕酮干预后，在2、5、10 Hz频率刺激下，阻滞率分别为（22±11）%、（38±14）%和（52±17）%，与普罗帕酮灌流前及普罗帕酮在0.06 Hz和1 Hz刺激时的阻滞率间的差异有显著统计学意义（P＜0.05），三组间两两比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。

结论：普罗帕酮减慢AP的Vmax，降低AP振幅，对APD无显著影响。普罗帕酮对快钠电流不但有张力性阻滞作用，更有显著的使用依赖性阻滞作用，这样不但减轻了对QT间期的影响，也可减少心动过缓的发生。

普罗帕酮；动作电位；快钠电流；张力性阻滞；使用依赖性阻滞

Methods: A total of 10 adult New Zealand white rabbits were sacrificed and 10 individual ventricular myocytes were isolated by enzyme digestion method. Microelectrode technologies were used to record AP-related parameters: maximum diastolic potential （MDP）, maximum rate of rise of the action potential upstroke （Vmax）, action potential amplitude （APA） and action potential duration at 20%, 50% and 90% （APD20, APD50and APD90）. INa-Twas measured, I-V curves and peak currents at different frequencies were detected by whole cell patch clamp before and after propafenone perfusion at 10 μmol/L.

Results: There was no statistical difference in MDP at before and after propafenone perfusion as （-80 ± 6） mV

vs （-82 ± 5） mV, P＞0.05. After perfusion, APA was significantly decreased as （95 ± 12） mV vs （ 125 ± 10） mV, P＜0.05, the Vmax slowed down as （330 ± 43） V/s vs （420 ± 54） V/s, P＜0.05, while APD20, APD50and APD90were unchanged as （8 ± 2）ms vs （6 ± 2） ms, P＞0.05, （16 ± 3） ms vs （12 ± 3） ms, P＞0.05 and （86 ± 14） ms vs （85 ± 12） ms, P＞0.05. After propafenone perfusion, I-V curve of INa-Twas shifted upward and the peak current was decreased as （3001 ± 383） pA vs （4193 ± 378） pA, P＜0.05. Before perfusion, when stimulated at 0.06 Hz, 1 Hz, 2 Hz, 5 Hz and 10 Hz, there were no significant use-dependent block in INa-T, and no real difference in INa-Tbetween the 10thand 1stpulse, P＞0.05. After perfusion, no significant usedependent block was observed when stimulated at 0.06 Hz and 1 Hz, P＞0.05, while at 2 Hz, 5 Hz and 10 Hz, propafenone perfusion demonstrated significant use-dependent block upon INa-Twith the inhibition fractions of （22 ± 11）%, （38 ± 14）% and （52 ± 17）% respectively, those were significantly different from the inhibition fractions at either 0.06 Hz or 1Hz, P＜0.05. When the inhibition fractions were compared by each 2 conditions, all P＜0.05.

Conclusion: Propafenone may slow down the Vmaxof AP, reduce APA and without the impact on APD; the effects on INa-Tis not only in tonic block, but also more obviously in use-dependent block in isolated ventricular myocytes of New Zealand rabbit. Such influences minimized the impact on QT interval and meanwhile, decreased the incidence of brad arrhythmia.

（Chinese Circulation Journal, 2015,30:679.）

普罗帕酮是临床常用的Ⅰc类抗心律失常药物，能直接稳定心肌细胞膜，用于多种心律失常治疗[1-3]，其电生理效应主要是降低单相动作电位（AP）的0相最大上升速率（Vmax）、延长有效不应期（ERP）。然而普罗帕酮对动作电位时程（APD）的影响却存在争议[4-7]，需要进一步研究明确。使用依赖性阻滞是钠通道药理作用的重要电生理学特征[8]，膜片钳技术是心脏电生理学研究的重要手段[9]，目前国内鲜有研究以急性分离的心室肌细胞系统评估普罗帕酮对钠通道的张力性阻滞和使用依赖性阻滞作用。本研究以急性分离的兔心室肌细胞作为材料，采用全细胞膜片钳技术，以普罗帕酮进行灌流，检测AP的相关参数以及快钠电流的张力性阻滞和使用依赖性阻滞的变化，探讨普罗帕酮的电生理效应。

1 材料与方法

兔心室肌细胞的分离：选取成年新西兰大白兔（1.8～2.3 kg）10只（宁夏医科大学动物中心提供，SPF级），先经甲苯噻嗪肌肉注射镇静，后穿刺耳缘静脉给予肝素钠（200 IU/kg）抗凝，然后以氯胺酮经耳缘静脉注射麻醉（35 mg/kg），迅速切除心脏，置于无钙台氏液中。游离主动脉根部，迅速将其悬挂于已经充灌无钙台氏液的灌流系统中，无钙台氏液灌流10～15 min以洗净残存血液。所有的灌流液在37℃用95%氧气-5%二氧化碳发泡，调整流速维持灌注压于75 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。然后以酶液（Ⅰ型胶原酶0.5 g/L、蛋白酶0.05 g/L、小牛血清白蛋白0.4 g/L+无钙台氏液）灌流心脏。20 min后取下，剪离左心室心肌，用眼科剪剪碎，再用尼龙网过滤细胞，并在室温下储存在KB液[（L-谷氨酸50.0，氯化钾40.0，磷酸二氢钾20.0，牛磺酸20.0， 氯化镁 3.0，氢氧化钾70.0，乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸 0.5，4-羟乙基哌嗪乙磺酸 10.0，葡萄糖 10.0，单位均为mmol/L，用氢氧化钾调pH值至7.4）]中。只有耐钙、杆状、有着清晰横纹且没有自发性收缩的细胞才被选作实验细胞。

AP的记录：在37℃下进行。跨膜电压使用3 mmol/L 氯化钾充灌的微电极（Sutter，美国）进行记录，阻抗在20～40 MΩ。通过记录电极起搏细胞，周长稳定为1 s，脉宽1 ms，起搏电压为阈电位的120%。药物灌流和冲洗时间足以达到稳态的药物效应。检测分析AP的最大舒张期电位、0相Vmax、AP振幅以及复极化20%、50%和90%的动作电位时程（APD20、APD50和APD90）。数据由检测10个心室肌细胞取得的AP平均值获得。

快钠电流检测：使用硼硅玻璃电极（Sutter，美国），充灌电极内液时阻抗≈ 1.0 ～2.0 MΩ。细胞外液组分为（单位mmol/L）：氯化钠 10，氯化铯130，氯化镁1.0，氯化钙1.0，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.0，葡萄糖10.0，氯化钴 0.3，用氢氧化钠调定PH值至7.4。电极内液组分为（单位mmol/L）：氯化钠 10.0，氟化铯110.0，氯化铯20.0，乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸5.0，镁-三磷酸腺苷5.0，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.0，用氢氧化钠调定pH 值至7.4。在倒置显微镜（Olympus，日本）下，利用三维液压微操纵器（Narishige，日本）使得电极尖端接近细胞，补

偿液接电位，向细胞壁施压后负压吸引，直到形成高阻封接（封接阻抗＞1 GΩ），给予快电容补偿，然后吸破细胞膜，形成全细胞记录，补偿慢电容和串联电阻，待破膜电压稳定后，记录电流。全细胞电流用Axopatch 200 A放大器（Axon，美国）进行记录，在5 kHz的低通电流滤过，经Digidata 1 200 A/D的脱线界面在5 kHz予以数字化处理。数据由检测10个心室肌细胞取得的快钠电流的平均值获得。

普罗帕酮干预和灌流：先以空白细胞外液灌流细胞池，记录快钠电流，然后以细胞外液为母液配制10 μmol/L普罗帕酮（Sigma，美国）溶液[5]，用蠕动泵以2 ml/min流速灌流细胞池，3 min后记录各种刺激条件下的快钠电流。

普罗帕酮对快钠电流I-V曲线的影响：在电压钳模式下，从钳制电压-80 mV逐步除极至+30 mV，阶跃+10 mV，维持时间100 ms，刺激频率1.0 Hz，以空白细胞外液灌流时最大电流作为标准，求得标化电流，并以刺激电压作为横坐标，标化电流作为纵坐标，制作I-V曲线。

普罗帕酮对快钠电流的张力性阻滞：钳制电位-90 mV持续15 s后阶跃至-30 mV，持续20 ms，诱发快钠电流。

普罗帕酮对快钠电流的使用依赖性阻滞：钳制电压-90 mV持续15 s后，由阶跃至-30 mV的一串10次连续脉冲刺激（持续20 ms）诱发。频率分别为0.06、1、2、5、10 Hz（前后两个刺激的间隔时间分别为15 s、1 s、500 ms、200 ms和100 ms）。以第1个刺激与第10个刺激诱发的快钠电流的差值与第1个刺激下快钠电流的比值求得阻滞分数，以阻滞分数来评价使用依赖性阻滞作用。

2 结果

普罗帕酮对兔心室肌细胞AP的影响（图1）：10 μmol/L普罗帕酮灌流后较灌流前兔心室肌细胞最大舒张电位无明显变化[（-80±6）mV vs（-82±5）mV，P＞0.05]，AP振幅显著降低[（95±12）mV vs （125±10）mV，P＜0.05，图1B]，Vmax明显减慢[（330±43）V/s vs （420±54）V/s，P＜0.05，图1C]，APD20[（8±2）ms vs （6±2）ms，P＞0.05]、APD50[（16±3）ms vs （12±3）ms，P＞0.05]和APD90[（86±14）ms vs （85±12）ms，P＞0.05]均无显著变化（图1D）。

图1 普罗帕酮对兔心室肌细胞动作电位的影响（n=10）

普罗帕酮对快钠电流I-V曲线的影响及张力性阻滞作用（图2、图3）：检测快钠电流后制作I-V曲线，结果显示普罗帕酮灌流前后翻转电位相同，均为-30 mV，I-V曲线明显下移（图2B）。在-90 mV钳制电位下，快钠电流峰值由（4 193±378）pA减低为（3 001±383）pA（P＜0.05，图3B）。

图2 普罗帕酮对快钠电流I-V曲线的影响（n=10）

图3 普罗帕酮对快钠电流的张力性阻滞作用（n=10）

不同频率下普罗帕酮对快钠电流使用依赖性阻滞作用的影响（图4）：普罗帕酮灌流前即空白细胞外液灌流时，以0.06、1、2、5、10 Hz刺激，快钠电流未显示使用依赖性阻滞作用，即第10个刺激与第1个刺激诱发的快钠电流无统计学差异（P＞0.05，图4A）。普罗帕酮灌流后，当以0.06 Hz和1 Hz刺激时，亦未显示出使用依赖性阻滞作用 [分别为：（3 101±313）pA vs （3 078±313）pA，P＞0.05；（3 122±321）pA vs （3 118±315）pA，P＞0.05]；但当以2、5、10 Hz频率刺激时，第10个刺激较第1个刺激诱发的快钠电流显著下降[依次为：（2 474±343）pA vs （3 124±315）pA，P＜0.05；（1 989±398）pA vs （3 208±320）pA，P＜0.05；（1 525±545）pA vs （3 174±318）pA，P＜0.05，图4A]，阻滞率分别为（22±11）%、（38±14）%和（52±17）%，与普罗帕酮灌流前10 Hz刺激时和普罗帕酮灌流后0.06、1 Hz刺激时阻滞率之间的差异以及三种状态下两两比较的差异，均有显著统计学意义（P＜0.05，图4B）。

3 讨论

本研究采用全细胞膜片钳技术对普罗帕酮对兔心室肌细胞的AP的影响进行了探讨，结果表明普罗帕酮灌流后兔心室肌细胞静息电位无明显变化，AP振幅降低，Vmax明显减慢，这与国外报道一致[5-7]。AP的振幅和Vmax与心肌的传导紧密相关，AP振幅降低、Vmax下降促使激动在心肌间的传导减慢，甚至传导阻滞，在房室结和希氏束-浦肯野系统可表现为A-H间期和（或）H-V间期延长，是普罗帕酮抗心律失常的机制之一。

本研究结果还表明，普罗帕酮对APD无明显影响，普罗帕酮灌流后APD20、APD50和APD90无显著变化。关于普罗帕酮对APD的影响目前报道不一。Burashnikov 等[5]的研究表明，普罗帕酮对心室肌细胞的APD90没有影响，但会选择性延长心房肌细胞的APD90。Lemmens等[6]的研究则表明，普罗帕酮可以缩短乳头肌和浦肯野纤维的APD。Koller等[7]的研究则表明，普罗帕酮延长APD90。生理条件下，普罗帕酮的电生理效应主要是由抑制快钠电流和快速激活的延迟整流钾电流（IKr）引起，其中对APD的影响主要通过IKr介导[10]。与以往研究不同的是，本文采用微电极技术在细胞水平对普罗帕酮对APD的影响进行了探讨，结果显示APD90无变化，提示在本研究的刺激频率和浓度条件下，普罗帕酮在抑制快钠电流使得快钠电流相关参数如Vmax显著减低的同时，对IKr无显著影响。在临床工作中，普罗帕酮的这种作用可以使其在有效抗心律失常的同时，不明显延长QT间期，减少了尖端扭转型室速的发生。但其在不同浓度和刺激频率下的效应仍有待进一步研究证实。

本研究结果还显示，普罗帕酮对快钠电流具有显著的张力性阻滞作用，普罗帕酮灌流后峰值电流明显下降。更为重要的是，在频率为2、5、10 Hz

刺激时，普罗帕酮对快钠电流具有明显的使用依赖性阻滞作用，且频率越快，阻滞作用越明显。

图4 不同频率刺激下普罗帕酮对快钠电流的使用依赖性阻滞作用（n=10）

顾名思义，“使用依赖性阻滞”的含义是依赖于钠通道“使用”的一种阻滞作用，而钠通道的“使用”意味着钠通道的开放，即钠通道开放（即“使用”）越多，药物对钠通道的阻滞作用就越明显。这直观地反映出使用依赖性阻滞的频率依赖性特征，即在一定频率范围内，其频率越快，药物的阻滞作用就越明显，电生理学机制之一是心肌不应期与频率相关，频率较快时不应期长，阻滞作用更显著，这是多种药物抗心律失常作用的基础和研究热点[11,12]。

与以往研究不同的是，本研究以急性分离的兔心室肌细胞作为标本，通过直接检测其快钠电流，显示了普罗帕酮使用依赖性阻滞的频率依赖性特点，表明使用依赖性阻滞只有在频率达到一定阈值时方才显现。这提示在临床应用中，当患者心率较慢时，普罗帕酮没有明显作用，这不啻是一种良好的安全保护作用，避免在心率较慢时进一步减慢心率和导致传导阻滞。而在心率较快时，则可较为显著地起到减慢心率和传导，从而减少和抑制快速性心律失常的发生，具有显著的临床价值。

总之，本研究结果表明，普罗帕酮不但对AP有明显抑制作用，使其振幅降低、Vmax减慢，且对快钠电流有显著的张力性阻滞和使用依赖性阻滞作用。这是普罗帕酮发挥其抗心律失常作用的机制，具有重要的临床指导价值，值得进一步研究探讨。

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Effects of Propafenone on Action Potential of Rabbit Ventricular Myocytes and the Use-dependent Block of Transient Sodium Current

LI Jing, ZHENG Xiao-yun, ZHOU Gang, ZHAO Yue-tao, YANG Zhen.
Department of Geriatrics, Beijing Hospital, Beijing （100730）, China

Objective: To study the effects of propafenone on action potential （AP） of rabbit ventricular myocytes with the tonic block and use-dependent block of transient sodium current （INa-T）.

Propafenone; Action potential; Transient sodium current; Tonic block; Use-dependent block

2015-01-07）

（编辑：朱柳媛）

100730 北京市，北京医院 老年医学部（李晶、周刚、赵籥陶）；中日友好医院（郑霄云）；宁夏医科大学总医院（杨震）

李晶 副主任医师 硕士 主要从事老年心血管疾病诊疗 Email：jing-li2000@126.com 通讯作者：杨震 Email: yangzhen080@163.com

R54

A

1000-3614（2015）07-0679-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.016