远端缺血后处理对兔心脏缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制研究

雷靖祎，常海霞，廖菽丹，马锋

远端缺血后处理对兔心脏缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制研究

雷靖祎，常海霞，廖菽丹，马锋

目的：观察远端肢体缺血后处理对兔心脏缺血/再灌注损伤的作用，并探讨其可能机制。

方法：36只健康新西兰大白兔随机分为6组（每组6只）：假手术组、缺血对照组、缺血后处理组（MPostC组）、远端肢体缺血后处理组（RPostC组）、缺血后处理+5-羟葵酸组（MPostC + 5-HD组）、远端肢体缺血后处理+5-羟葵酸组（RPostC + 5-HD）。结扎左冠状动脉左室支45 min，再灌注120 min造模，结扎双侧髂外动脉5 min骨骼肌短暂缺血。于缺血前、后及再灌注1 h、2 h观察心功能指标和肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）活力及心肌梗死范围。

结果：（1）再灌注1 h、2 h后，MPostC组、RPostC组心功能指标较缺血对照组明显改善（P＜0.05）。MPostC+5-HD组、RPostC+5-HD组分别较MPostC组、RPostC组改善不明显（P＜0.05）；（2）再灌注2 h时，MPostC组、RPostC组的CK、LDH活力均显著低于缺血对照组（P均＜0.05），MPostC+5-HD组、RPostC+5-HD组的CK、LDH活力分别较MPostC组、RPostC组明显增高（P均＜0.05）；（3）缺血对照组的缺血范围[缺血区重量/左心室重量（AAR/LVg），缺血区面积/左心室面积（AAR/LVs）]与其他5组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；MPostC组、RPostC组梗死范围[梗死区重量/缺血区重量（AN/AARg）、梗死区面积/缺血区面积（AN/AARs）]均较缺血对照组明显降低（P均＜0.05），MPostC+5-HD组、RPostC+5-HD组分别与MPostC组、RPostC组比，梗死范围均增加（P均＜0.05）。MPostC+5-HD组、RPostC+5-HD组、缺血对照组的梗死范围组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

结论：经典的缺血后处理和远端肢体缺血后处理对心脏缺血/再灌注损伤均有明显的保护作用，其共同的机制可能为线粒体ATP敏感钾通道（MitoKATP）的激活。

远端缺血后处理；缺血/再灌注损伤；心脏保护；ATP敏感性钾通道

Methods: A total of 36 healthy New Zealand rabbits were divided into 6 groups: ①Sham group, ②Ischemic reperfusion control （CON） group,③Myocardial ischemic post-conditioning （MpostC） group,④Remote ischemic post-conditioning（RPostC） group, ⑤MPostC+5-HD group, ⑥RPostC+5-HD group. n=6 in each group. The ischemic reperfusion injury model was established by left ventricular descending artery occlusion for 45 min followed by reperfusion for 120 min. Bilateral external iliac artery was occluded for 5 min to induce the short skeletal muscle ischemia. The indexes of cardiac function and plasma CK , LDH activities were measured at baseline, end of ischemia and 1, 2 h after reperfusion respectively, the sizes of myocardial infarction （MI） were examined and compared among different groups.

Results: ①Compared with CON group, the indexes of cardiac function were improved in MPostC and RPostC groups at 1, 2 h after reperfusion, P＜0.05, and compared with MPostC group and RPostC group, the indexes of cardiac function were improved in MPostC+5-HD and RPostC+5-HD groups, P＜0.05. ②Compared with CON group, plasma CK, LDH activities

were decreased in MPostC and RPostC groups at 2 h after reperfusion, P＜0.05, and compared with MPostC group and RPostC group, the CK, LDH activities were increased in MPostC+5-HD and RPostC+5-HD groups, P＜0.05. ③The ischemic ranges and areas were similar between CON group and the other 5 groups P＞0.05. The MI ranges and areas in MPostC and RPostC groups were much less than that in CON group, P＜0.05, and compared with MPostC group and RPostC group, the MI ranges and areas increased in MPostC+5-HD and RPostC+5-HD groups, P＜0.05. The MI ranges and areas were similar between CON group and MPostC+5-HD, RPostC+5-HD groups, P＞0.05.

Conclusion: Classical ischemic post-conditioning and remote organ ischemic post-conditioning both have protective effect on myocardial reperfusion injury in experimental rabbit, which might be related to the activation of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels.

（Chinese Circulation Journal, 2015,30:699.）

组织细胞缺血一段时间，当重新恢复血流灌注后，细胞功能代谢障碍及结构反而较恢复血流灌注前加重，器官功能进一步恶化，这称为缺血/再灌注损伤（Ischemia/reperfusion injury， I/RI）。随着溶栓、介入治疗的广泛应用，I/RI已经成为临床普遍存在的器官损伤现象。Zhao等[1]首次发现缺血后处理（Ischemic postconditioning，IPTC）具有明显缩小心肌梗死面积、抗再灌注心律失常、改善心肌舒缩功能、抑制心肌细胞凋亡等作用，可以明显减轻心脏I/RI，因其弥补了缺血预处理在干预时间上的不足，越来越引起研究者的关注。进一步的研究发现远端器官如肾脏、小肠、骨骼肌等的缺血后处理，均可以减轻I/RI而产生心肌保护作用，特别是骨骼肌远端缺血后处理因其简单方便日益为学者所重视[2]。然而，远端器官IPTC对于I/RI发挥保护作用的机制目前仍不完全明了，本试验旨在通过骨骼肌远端缺血后处理观察其对兔心脏I/RI的影响，及对其可能的机制进行探讨。

1 材料与方法

实验动物：36只健康雄性新西兰大白兔（解放军第四军医大学实验动物中心提供），体重2.5～3.0 kg，随机分成6组，每组6只。假手术组：手术开胸暴露心脏左冠状动脉的左室支，只穿线，不结扎；缺血对照组：左室支结扎45 min，后再灌注2 h；心肌缺血后处理组（MPostC组）：在心肌缺血末再灌注开始时，对结扎的左室支给予开通30 s再闭塞30 s，循环3次，后再灌注2 h；远端肢体缺血后处理组（RPostC组）：分离双侧髂外动脉，在心肌缺血末再灌注开始前12 min，用动脉夹夹闭双侧髂外动脉，行缺血5 min后在开通1 min，循环2次，并于心肌再灌注时同时松开双侧髂外动脉，与心肌同时灌注2 h；心肌缺血后处理组+5-羟葵酸组（MPostC + 5-HD组）：在心肌缺血末再灌注开始时，在给予缺血后处理的同时，经左心室导管给予线粒体三磷酸腺苷（ATP）敏感钾通道（mitoKATP）特异性阻滞剂5-HD（美国Sigma公司） 5 mg/kg，余同心肌缺血后处理组；远端肢体缺血后处理组+5-羟葵酸组（RPostC + 5-HD组）：在心肌缺血末再灌注开始时，在给予远端肢体缺血后处理的同时，经左心室导管给予5-HD 5 mg/kg，余同远端肢体缺血后处理组。

心肌梗死模型制备：3%戊巴比妥纳30 mg/kg麻醉，气管插管，接小动物呼吸机，左颈总动脉插管监测血压、心率，心电图机记录心电图。小止血钳夹断3、4肋软骨，开胸暴露心包，剪开心包找出左冠状动脉的左室支，左心耳到心尖连线的中点处，5-0针线缝扎左室支，内径0.5 cm的硅胶管套线，束紧后止血钳夹紧线，观察心肌颜色，中心缺血区由红色变暗灰色，缺血区周边有暗红色的充血带，心电图出现明显的T波高尖、ST段上抬，提示心肌缺血。阻断前给予肝素500 U/kg，缺血45 min后，松开夹线钳（但不抽出丝线），心肌缺血区有充血反应，再灌注2 h，I/RI损伤模型建立。

双下肢骨骼肌缺血的制备：制作心肌梗死模型前，2%利多卡因局麻双侧腹股沟区，分离髂外动脉，应用动脉夹同时夹闭双侧髂外动脉固定位置，通过远端动脉搏动消失及恢复反映下肢I/RI情况。

检测指标：（1）心功能指标：左颈总动脉插管入左心室，连接信号处理系统，在不同时间点（基线、心肌缺血45 min及再灌注1 h、再灌注2 h）描记心电图、心率、左心室收缩压（LVSP）及左心室舒张末

期压力（LVEDP）；（2）血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）活性测定：分别于结扎冠状动脉前、缺血45 min、再灌注1 h、再灌注2 h，从左侧颈动脉采血5 ml，3 500 r/min离心10 min分离血清，按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）要求测CK、LDH活力水平。（3）心肌缺血、梗死程度：再灌注2 h后，重新结扎冠状动脉，颈静脉注入4 ml 2%（w/v）伊文氏兰，2 min后将心脏剪下，-20℃冰冻1 h后，切成1.0～1.5 mm厚的薄片，置于1% 氯化三苯四唑（TTC）中，37℃温育15 min，用数码相机拍摄心脏切面。用Optimas软件统计心肌坏死区（白色）、缺血区（红色和白色）和非缺血区（蓝色）面积。吸干水分后称取各区重量，以重量和面积评价心肌缺血及梗死程度。缺血程度用缺血区重量/左心室重量（AAR/LVg）、缺血区面积/左心室面积（AAR/ LVs）表示；梗死程度用梗死区重量/缺血区重量（AN/AARg）、梗死区面积/缺血区面积（AN/AARs）表示。

2 结果

2.1 6组大白兔不同时间点心功能指标的变化（表1、2）

基线、缺血时、再灌注时，6组大白兔的心率差异均无统计学意义（P均＞0.05）。基线时（缺血前）6组大白兔的LVSP和LVEDP差异无统计学意义（P均＞0.05）。缺血45 min时，与假手术组比，其他5组LVSP均显著下降 、LVEDP显著升高（P均＜0.05）。再灌注1 h、2 h后，MPostC组、RPostC组LVSP较缺血对照组明显增高，LVEDP明显降低（P均＜0.05）。MPostC+5-HD组、RPostC+5-HD组分别较MPostC组、RPostC组LVSP明显降低，LVEDP明显升高（P均＜0.05）。

表1 6组大白兔不同时间点的心率变化比较

表1 6组大白兔不同时间点的心率变化比较

注：MPostC：心肌缺血后处理；RPostC：远端肢体缺血后处理； 5-HD：5-羟葵酸

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表2 6组大白兔不同时间点的左心室收缩压和左心室舒张末期压力的比较（

表2 6组大白兔不同时间点的左心室收缩压和左心室舒张末期压力的比较（

注：与假手术组比*P＜0. 05；与缺血对照组比△P＜0. 05；与MPostC组比▲P＜0. 05 ；与RPostC组比#P＜0. 05。余注见表1

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2.2 6组大白兔不同时间点血清肌酸激酶及乳酸脱氢酶活力比较（表3）

基线和缺血45 min时，6组大白兔CK、LDH活力差异无统计学意义（P均＞0.05）。再灌注1 h、2 h时，与假手术组比较，其他5组大白兔CK、LDH活力均显著升高（P均＜0.05）；再灌注2 h时，MPostC、RPostC 组的CK、LDH活力均显著低于缺血对照组（P均＜0.05）。再灌注2 h时，MPostC+5-HD组、RPostC+5-HD组大白兔的CK、LDH活力分别较MPostC组、RPostC明显增高（P均＜0.05），MPostC+5-HD组、RPostC+5-HD组与缺血对照组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 6组大白兔心肌缺血程度和梗死程度的比较（表4）

6组大白兔心肌缺血程度（AAR/LVg、AAR/ LVs）的差异均无统计学意义（P＞0.05）。MPostC组、RPostC组与缺血对照组比，梗死程度（AN/AARg、AN/AARs）均明显降低（P均＜0.05）。MPostC+5-HD组、RPostC+5-HD组的梗死程度（AN/AARg、AN/AARs）分别较MPostC组、RPostC组明显增高（P＜0.05），MPostC+5-HD组、RPostC+5-HD组、缺血对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 6组大白兔不同时间点的血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶活力比较

表3 6组大白兔不同时间点的血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶活力比较

注：与假手术组比*P＜0. 05；与缺血对照组比△P＜0. 05；与MPostC组比▲P＜0. 05 ；与RPostC组比#P＜0. 05。余注见表1

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表4 6组大白兔心肌缺血程度和梗死程度的比较

表4 6组大白兔心肌缺血程度和梗死程度的比较

注：与缺血对照组比*P＜0. 05；与MPostC组比△P＜0. 05 ；与RPostC组比▲P＜0. 05。-：无；余注见表1

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3 讨论

心肌缺血发生后，尽早开通闭塞血管，恢复缺血心肌有效的灌注，是限制和缩小梗死面积、改善预后的关键，然而I/RI却严重影响了血管开通的治疗效果。研究发现缺血预处理和缺血后处理可以使心肌细胞耐受更长时间的缺血/再灌注所导致的损伤，是有效的内源性心肌保护策略。其中缺血后处理弥补了缺血预处理在干预时间上的不足，而远端器官的缺血后处理，因其操作起来简单方便，更加为学者所重视。

2003年，Zhao等[1]以采用夹闭犬前降支60 min后再灌注的方法，建立在体急性心肌梗死模型，于再灌注开始即刻对夹闭的血管进行30 s再灌注/30 s缺血，交替3次，之后持续再灌注3 h，发现心肌梗死比例和血浆CK活性明显降低，与缺血预处理组相比无显著差异，初步证实了缺血后处理能够改善再灌注心脏功能，减少梗死面积。2005年，Kerendi等[2，3]通过再灌注前阻断肾动脉及复流，减少了大鼠缺血再灌注心肌的梗死面积达50%，由此提出远隔器官缺血后处理的概念。由于四肢对缺血耐受性好，且容易观察缺血程度及方便实施缺血处理，因此较肾脏更具临床应用前景。

我们的实验采用阻断兔左室支造模，分别给予经典缺血后处理和骨骼肌缺血后处理的方法，发现不论是采用经典的缺血后处理还是远隔器官缺血后处理（骨骼肌），对I/RI均能产生明显的心脏保护作用，表现在：（1）心功能方面：再灌注1 h后，缺血后处理组和远隔器官缺血后处理组心功能指标均较缺血对照组明显改善，且作用持续到再灌注2 h后；（2）心肌酶方面：缺血后处理组和远隔器官缺血后处理组血浆CK及LDH活力于再灌注1 h及2 h的变化趋势均较缺血对照组明显降低；（3）心肌梗死面积方面：与缺血对照组相比，不论是经典的缺血后处理还是远隔器官缺血后处理均能显著降低心肌梗死面积，而且两者间差异无统计学意义。而且我们发现，不论是经典的缺血后处理还是远隔器官缺血后处理其对I/RI所产生明显的心脏保护作用均被mitoKATP阻滞剂5-HD所阻断，提示mitoKATP在缺血后处理心肌保护机制中发挥重要作用。

目前认为缺血后处理产生心脏保护作用是通过再灌注损伤补救酶通路（RISK）来完成的，它可能抑制线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放进而减少心肌细胞的坏死[3]，后者在再灌注开始时开放，能促进细胞凋亡和加速细胞死亡进程。缺血后处理通过激活阿片样物质及选择性阿片受体、释放内源性腺苷、减少氧自由基生成、增加内源性一氧化氮产生、减少炎症因子释放以及下调组织因子表达等作用，激活细胞膜受体，进而激活磷脂酰肌醇3激酶—丝/苏氨酸激酶（PI3-Alt）[4，5]和细胞外信号调节激酶（ERK）两条再灌注损伤补救激酶途径[6，7]。在这一过程中，腺苷、阿片类物质和缓激肽是主要作用物质，mPTP的开放是导致再灌注细胞死亡的关键因素。研究发现，mitoKATP的激活开放在减轻I/RI中扮演重要角色，其激活后能够关闭mPTP[8]，进而抑制细胞色素C、凋亡诱导因子、核酸内切酶等，从而抑制线粒体介导的细胞凋亡通路的激活[9-11]；此外mitoKATP的激活使K+内流增加，降低了线粒体膜电

位差，减少Ca2+内流，减轻了线粒体Ca2+超载和基质水肿，减轻心肌能量代谢障碍，减少自由基的生成，最终实现心肌保护作用[12-14]。

对于远隔器官缺血后处理目前研究较少，其保护作用的确切机制目前尚不清楚，有研究表明非选择性的腺苷受体阻滞剂8-SPT可以抑制肾动脉缺血后适应的保护作用[2]。Loukogeoragakis等[11]发现，健侧肢体的短时间远隔缺血后处理可以保护人类伤侧肢体的血管内皮细胞功能，而非选择性KATP抑制剂格列本脲阻断其作用，提示KATP在远隔器官缺血后处理中发挥重要作用。本实验发现，5-HD可以阻断不论是经典的缺血后处理还是远隔器官缺血后处理的心脏保护作用，从而说明缺血后处理和远隔器官缺血后处理均通过激活mitoKATP这一机制发挥心脏保护作用。

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Protective Effect and its Mechanism for Remote Ischemic Post-conditioning in Myocardial Ischemia/reperfusion Injury in Experimental Rabbits

LEI Jing-yi, CHANG Hai-xia, LIAO Shu-dan, MA Feng.
Department of Cardiology, Xi’an Central Hospital, Xi’an （710003）, Shaanxi, China

Objective: To observe the protective effect of ischemic post-conditioning on myocardial reperfusion injury with the potential mechanism in experimental rabbits.

Remote post-conditioning; Ischemia/reperfusion injury; Cardiac protection; ATP-sensitive potassium channels

2014-10-12）

（编辑：许 菁）

710003 陕西省，西安市中心医院 心内科

雷靖祎 副主任医师 硕士 主要从事冠心病及心律失常介入治疗 Email：807310866@qq.com 通讯作者：雷靖祎

R54

A

1000-3614（2015）07-0699-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.020