足细胞自噬在足细胞病中的研究进展

黄 勇综述 曹式丽审校

◇综 述◇

足细胞自噬在足细胞病中的研究进展

黄 勇1综述 曹式丽2审校

对近年来足细胞自噬在足细胞病中的作用及其机制的研究进行了概述，阐述了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在足细胞自噬中扮演的角色。足细胞自噬活性的改变与足细胞病的进程密切相关，mTOR信号通路介导的自噬途径是足细胞保持自身稳定的重要调节器，以调控足细胞自噬平衡体系为干预靶点可能成为足细胞病防治的新靶点。

自噬；足细胞自噬；足细胞病；mTOR

足细胞即肾小球脏层上皮细胞，是一种高度分化的终末细胞，其结构和功能的正常对维持肾小球滤过屏障的完整性非常重要。自噬是近年来细胞生物学领域研究的热点。自噬过度、障碍造成的细胞损伤及其诱导的细胞程序性死亡在疾病的发生、发展过程中起着重要作用。自从发现肾小球足细胞中存在自噬现象，足细胞自噬在足细胞病发生、发展中所扮演的角色已成为新的研究方向。该文就近年来足细胞自噬在足细胞病中的研究进展及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路在足细胞自噬中扮演的角色进行阐述。

1 自噬与细胞的生理病理

自噬是一种广泛存在于真核细胞内溶酶体依赖性蛋白及细胞器的分解代谢途径。目前研究将自噬分为三种：巨自噬、微自噬和分子伴侣自噬［1］。其中巨自噬指细胞质中可溶性蛋白和变性坏死的细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构所包裹，继而被溶酶体内水解酶降解的过程；微自噬中溶酶体膜内叠，使得一部分细胞质直接进入溶酶体腔而被分解；分子伴侣自噬需要细胞质可溶性蛋白直接通过溶酶体膜，预先有伴侣分子将目标蛋白解构变性。而自噬通常是指巨自噬，是其中研究最多的一种。自噬是胞质中大分子物质和细胞器在双层膜包囊泡中大量降解的生物学过程，其过程大致包括4个阶段［2］：①隔离膜的形成：在饥饿、氧化应激损伤等自噬诱导因素的刺激下，粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形成杯状隔离膜，包裹在需降解的蛋白质或细胞器周围；②自噬体的形成：隔离膜逐渐延伸，将需降解的底物完全包绕形成自噬体；③自噬性溶酶体的形成：自噬体通过细胞骨架微管系统将其包裹的底物运输至溶酶体，并与之融合形成自噬性溶酶体；④自噬体内容物的降解：自噬体与溶酶体融合后，自噬体内膜及其内容物被溶酶体中多种蛋白水解酶降解，自噬体膜脱落循环利用。

生理状态下，几乎所有细胞都存在基础水平的自噬。正常水平的自噬可以清除未折叠或折叠错误的蛋白质，降解蛋白质产生氨基酸等供细胞再循环，从而维持细胞生存及内环境的稳定。自噬可被多种因素激活，如营养或生长因子缺乏、缺氧、活性氧刺激、DNA损伤、蛋白质聚集、细胞器损伤或细胞内病原体侵袭等因素［3］。在大多数情况下，自噬参与细胞的应激反应，帮助细胞适应营养变化，维持细胞稳态，延续细胞生命，是细胞对外界因素刺激的一种适应性反应，是细胞的一种自我保护机制，可阻抑有害应激所诱导的细胞凋亡［4］。对于肿瘤细胞，自噬具有抑制和促进的双重作用，如在肿瘤发生初期自噬活性的增强可作为一种抑制因素，而在肿瘤生长过程中却可为肿瘤扩增提供营养，促进肿瘤细胞的增殖，而且自噬在不同类型肿瘤中扮演的角色亦不相同［5］。因此，自噬与细胞的生理和病理关系密切。目前研究对自噬在疾病中所扮演的角色尚无定论，探索其在不同疾病中的作用及其具体作用机制具有重要意义。

2 足细胞自噬与足细胞病

2002年足细胞病的概念首次被提出，以肾小球足细胞数量和（或）密度减少、肾小球基底膜增厚、肾小球基质成分改变、足突融合等为特征的肾小球疾病统称为足细胞病。足细胞是一种高度分化的终末细胞，其足突包绕在肾小球基底膜上，形成裂孔隔膜复合体，其结构的完整性与肾小球滤过屏障功能的正常密切相关。足细胞的损伤和缺失是导致肾脏疾病发生及发展至肾功能衰竭的主要原因，足细胞数量的减少是预测肾脏疾病进展的重要指标［6］。成熟足细胞缺失后仅能依赖于足细胞的祖细胞再生，其再生能力极其微弱。且初始的局部损伤的足细胞可产生“多米诺效应”，将损伤信号传递至正常足细胞，使疾病迅速发展至肾小球硬化［7］。因此，维护足细胞结构和功能的正常，阻抑足细胞的损伤是肾脏病防治的重要环节。

自噬在肾脏疾病的研究已历经半世纪。1956年，Clark［8］通过电镜观察到小鼠肾组织细胞中存在大量具有膜性结构的致密体，并发现其胞质中常含有类似于线粒体的结构。当时学者们对自噬了解尚少，对自噬这一现象也没有明确定义。1983年，Berkenstam et al［9］从大鼠近端肾小管细胞中分离出自噬性囊泡，证明大鼠肾脏固有细胞中存在自噬现象，自噬在肾脏病领域开始受到关注。2003年Asanuma et al［10］发现足细胞的分化和损伤修复过程存在自噬现象。加之同期足细胞病概念的提出，使得众多研究者开始探索足细胞自噬在足细胞病中所扮演的角色。Mizushima et al［11］通过绿色荧光蛋白标记LC3（green fluorescent protein marked LC3，GFPLC3）转基因小鼠模型发现肾小球足细胞显著表达自噬，提示足细胞中存在基础自噬活性。Hartleben et al［12］用GFP-LC3作为自噬体免疫荧光标志物来检测机体内自噬水平，发现肾小球足细胞中LC3-Ⅱ的堆积速度明显高于肾脏其他细胞，说明足细胞相比于肾脏其他细胞表达出更高的自噬水平。且足细胞基础自噬活性是维持足细胞结构及功能完整性的重要机制，足细胞自噬平衡体系失衡会增加肾小球疾病易感性。糖尿病肾病是一种常见的足细胞病，高糖刺激可以引起足细胞自噬活性受到抑制，给糖尿病小鼠腹腔注射雷帕霉素可以减轻肾小球病理改变和足细胞损伤，其作用可能与促进足细胞自噬有关［13］。在肾活检病理表现为微小病变（minimal change disease，MCD）的患者中，足细胞自噬相关基因Beclin-1表达明显高于局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerular sclerosis，FSGS）患者，且对MCD患者重复肾活检时发现，Beclin-1表达无明显变化者其病理类型仍为MCD，而Beclin-1表达明显下降、足细胞自噬活性降低者肾脏病理已转化为FSGS［14］，说明足细胞自噬活性的改变与足细胞病的进程密切相关。上述研究结果提示：以调控足细胞自噬平衡体系为干预靶点或可为足细胞病的治疗提供新的可行途径。

3 m TOR信号通路——足细胞自噬“调节器”

细胞通过自噬来循环利用破损和无用的细胞器及大分子，同时产生能量，并恢复正常生长所需要的构件前体。mTOR和细胞自噬有着紧密联系，在mTOR和细胞自噬联系出现缺陷的地方，可引起肿瘤和神经退行性病变等一系列疾病的发生［15］。mTOR是细胞内一种高度保守的丝／苏氨酸（Ser／Thr）蛋白激酶，其作为能量代谢的调控器，可整合营养、生长因子以及多种细胞外信号，参与基因转录、蛋白质的翻译、核糖体的合成等生物过程，在维持细胞的结构和功能中发挥着重要的作用［15］。参与调节足细胞自噬平衡体系的分子系统非常复杂，目前研究主要集中在mTOR、核转录因子等信号通路。其中，mTOR是生理及应激条件下协调生长与自噬之间平衡的关键成分，是多条信号通路的汇聚点，成为目前自噬相关信号通路研究的热点。

mTOR属磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide-3 kinase ELISA Kit，PI3K）相关蛋白激酶家族，具有Ser／Thr蛋白激酶活性，能磷酸化蛋白底物的Ser／Thr残基。细胞内存在mTOR复合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTOR复合物2（mTOR complex 2，mTORC2）两种复合体。mTORC1复合体由mTOR蛋白和分别对复合体起正负调节作用的mTOR调控相关蛋白Raptor、Deptor等附属蛋白组成，主要参与调节细胞生长、细胞凋亡、能量代谢和细胞自噬等［16］。mTORC2构成包括Rictor及mSin1，通过磷酸化蛋白激酶C-a（protein kinase phosphorylation ca，PKC-a）通路来调节肌动蛋白，在肌动蛋白细胞骨架、细胞存活及代谢等方面发挥重要作用［17］。由于mTOR-Rictor复合物不能结合FKBP12-雷帕霉素耦联体，mTORC2对雷帕霉素表现为不敏感。而最近研究［18］显示延长雷帕霉素治疗时间可以影响Rictor与mTORC2的结合。细胞自噬的起始阶段是由ULK1及VPS34两种蛋白激酶调控，ULK1是VPS34的上游蛋白，ULK1会在细胞缺乏营养的时候激活，ULK1和VPS34的激活使自噬基因（autophagy-related gene，ATG）蛋白聚集形成吞噬泡膜从而促进自噬体的成熟，同时，ULK1和VPS34还能与mTORC1信号产生相互作用从而影响自噬［19］。mTORC1参与自噬的调节与PI3K／蛋白激酶B（Akt）信号通路密切相关。磷酸肌醇三磷酸（inositol triphosphate phosphate，PI3P）在这个过程中是一个重要的细胞内信号，其可与多种具有同源性底物的蛋白质相结合，如磷脂酰肌醇依赖性激酶1和Akt，PI3P与PDK1的结合可使Akt磷酸化、激活，激活的Akt进一步使细胞核和细胞质中的其他目标蛋白磷酸化，从而抑制mTORC1的激活，提高细胞内的自噬活性［20］。此外，mTOR磷酸化的ATG13会降低ATG13和ATG1的亲和力，而ATG1-ATG13的联合以及下一步ATG1的激活对细胞自噬非常重要，因此在细胞营养充分时，mTOR诱导的ATG1解离有效阻止了细胞自噬［21］。上述研究提示，mTOR介导的自噬途径是细胞自噬的重要调节器，且这一过程受多种细胞因子及信号的影响。

基础状态下，足细胞依赖于极低水平的mTOR活性及高水平的自噬活性以维持自身动态平衡。当肾小球应激下改变这种平衡，导致mTOR活性增强和自噬活性减弱，则会造成足细胞损伤。Raptor和Rictor分别是mTORC1和mTORC2非常重要的亚单位。Godel et al［22］通过特异性敲除足细胞Raptor和Rictor显示，剔除Raptor导致蛋白尿，足突变宽和消失，进行性肾小球硬化；而剔除Rictor的足细胞只是在应激（如用牛血清蛋白刺激）情况下表达出极小的表型变化，提示mTORC2对足细胞的作用不是十分明显；而同时剔除了Raptor和Rictor的足细胞直接导致肾脏衰竭和快速死亡。提示mTORC1活性降低可导致足细胞损伤，Raptor和Rictor两者都敲除比单独敲除其中一个导致更严重的足细胞损伤，mTORC1和mTORC2在足细胞发育中起着重要的协同作用。此外，研究［23］表明过度激活mTORC1会引起小鼠肾小球系膜扩张、足细胞胞体增大、足突消失、肾小球硬化，并在14周龄时因肾衰竭而死亡。这些研究［22－23］提示，体内不表达或过度表达mTORC1都会导致足细胞结构和功能的改变。糖尿病高血糖状态下mTOR过度表达，自噬被抑制，这种持久性的刺激导致足细胞衰退，出现蛋白尿及肾小球硬化。在给予糖尿病肾病小鼠雷帕霉素后，发现足突融合明显减少［24］。而雷帕霉素参与调节足细胞自噬的机制可能在于其与FK-结合蛋白12（FK-BP12）相结合，形成RPM／FKBP12复合物，阻碍Raptor和mTOR结合，从而影响mTORC1活性，阻止细胞周期中G1期向S期转化，阻断细胞钙依赖性和非钙依赖性的信号传导通路，从而抑制蛋白质翻译的启动而实现［25］。

综上所述，自噬普遍存在于真核细胞中，可以清除细胞中损伤或衰老的细胞器及生物大分子，具有保护细胞的作用。自噬是足细胞的一种自我保护机制，自噬体系失衡与足细胞病的发生、发展密切相关。随着研究的不断深入，其在足细胞病中的具体作用机制也将逐步明朗。寻求一种有效调控足细胞自噬平衡体系以阻抑足细胞损伤的途径是目前亟待解决的问题。从自噬的角度出发，有效调控肾小球足细胞自噬内稳态的重要“调节器”——mTOR信号通路，或可为足细胞病的防治提供新思路。

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R-1

A

1000－1492（2015）08－1200－04

2015－03－25接收

国家自然科学基金（编号：30772808）

1天津中医药大学研究生院，2天津中医药大学第一附属医院肾病科，天津 300193

黄 勇，男，博士研究生；

曹式丽，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：shilicaoTCM＠163.com