当归补血汤对尿毒症大鼠心肌纤维化组织瞬时受体电位M7通道表达及胶原蛋白合成的影响*

王琳娜，陈常勇，陈小永，郭存霞，陈香美

[1.河南省中医院肾病科，河南 郑州 450002；2.中南大学湘雅医院放射科，湖南 长沙 410008；3.中国人民解放军总医院肾脏病科（肾脏疾病国家重点实验室），北京 100853]

·论著·

当归补血汤对尿毒症大鼠心肌纤维化组织瞬时受体电位M7通道表达及胶原蛋白合成的影响*

王琳娜1，陈常勇2，陈小永1，郭存霞1，陈香美3

[1.河南省中医院肾病科，河南 郑州 450002；2.中南大学湘雅医院放射科，湖南 长沙 410008；3.中国人民解放军总医院肾脏病科（肾脏疾病国家重点实验室），北京 100853]

目的观察当归补血汤（DBD）对尿毒症大鼠心肌组织瞬时受体电位M7通道（TRPM7）表达及胶原蛋白合成的影响，探讨DBD抗尿毒症心肌纤维化（UMF）作用机制。方法采用腺嘌呤核苷酸灌胃制作尿毒症模型，雄性SD大鼠32只，随机分为对照组、模型组、依那普利组及DBD组。依那普利和DBD组自造模第1天开始分别以依那普利10 mg/（kg·d）或DBD 6 g/（kg·d）灌胃；直至第21天，模型组和对照组以等体积的生理盐水灌胃。造模后第21天处死大鼠，留取血液标本检测血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）和心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）。留取心肌标本，行苏木精-伊红染色（HE）和Masson染色，观察各组大鼠心肌组织病理改变。采用实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌组织TRPM7 mRNA和转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA的表达。应用Western blot检测心肌组织TRPM7、Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）和Ⅲ型胶原蛋白（ColⅢ）的表达。结果 与对照组比较，模型组大鼠心肌病理评分增加，心肌间质胶原蛋白相对面积增大，血清BUN、Scr和（cTnⅠ）水平提高，TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表达增强，心肌组织TRPM7、ColⅠ和ColⅢ的表达增强。与模型组比较，经依那普利和DBD治疗后，心肌组织病理评分和心肌间质胶原蛋白相对面积缩小，血清BUN、Scr和cTnⅠ水平下降，TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表达减弱，心肌组织TRPM7、ColⅠ和ColⅢ的表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。与依那普利组比较，DBD组能明显降低TGF-β1mRNA的表达。结论DBD可减轻尿毒症大鼠心肌纤维化程度，这一作用与抑制心肌组织TRPM7表达，从而抑制胶原蛋白合成有关。

心肌纤维化；尿毒症；瞬时受体电位M7通道；当归补血汤

心血管疾病是慢性肾疾病的常见并发症，尿毒症心肌纤维化（uremic myocardial fibrosis，UMF）是在慢性肾疾病基础上并发心肌肥大和心室重塑的主要病理基础[1]。成纤维细胞是主要心肌细胞之一，占心肌细胞总量的75%。近期研究表明，钙离子通道在心肌成纤维细胞增殖、分化和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分的合成中起重要作用[2]。瞬时受体电位通道（transient receptor potential，TRP）是Ca2+、Mg2+阳离子信号通道，其在心肌成纤维细胞中广泛表达，瞬时受体电位M7通道（transient receptor potential melastatin 7，TRPM7）在转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β1）信号通路中也起重要的调节作用。那么TRPM7在UMF组织中的表达如何，当归补血汤（danggui buxue decoction，DBD）对UMF和TRPM7表达有无影响，目前未见报道。本实验拟通过UMF大鼠模型观察TRPM7、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白（collageⅠ，ColⅠ）及Ⅲ型胶原蛋白（collageⅢ，ColⅢ）表达的变化，探讨DBD抗纤维化作用与TRPM7的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雄性Sprague Dawley大鼠32只，体重180～220 g，由河南省中医院实验动物中心提供，分为造模组（24只）和对照组（8只）。造模组以3%腺嘌呤核苷酸灌胃制备尿毒症大鼠模型，21 d成模后再分为模型组、DBD组和依那普利组，每组8只大鼠。DBD组自造模第1天开始给予DBD 6 g/（kg·d）直至第21天；依那普利组自造模第1天开始给予依那普利10 mg/（kg·d）直至第21天；模型组和对照组给予等量生理盐水灌胃。

1.2 主要材料

总RNA提取试剂盒（R Neasy Mini Kit试剂盒）购自美国Qiangen公司，逆转录试剂盒购自美国Promega公司，实时定量逆转录-聚合酶链反应（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，real-time PCR）试剂盒（q-PCR Mixture）购自日本TaKaRa公司，荧光探针实时定量PCR仪（ABI 7900HT）购自美国Applied Biosystems公司。real-time PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成，大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）试剂盒购自美国LDI公司，羊抗ColⅠ和羊抗ColⅢ多克隆抗体购自美国Santa Cruze公司，鼠抗TRPM7单克隆抗体和鼠抗β-actin单克隆抗体购自美国Sigma公司，二抗购自美国Sigma公司，增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显色液购自美国Pierce公司。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及cTnⅠ的检测各组大鼠处死，经心脏取血2 ml，冰上静置10 min，4℃离心，取上清液，置入-20℃冰箱保存。全自动生化分析仪检测Scr、BUN水平，酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测血清中cTnⅠ的含量。

1.3.2 心肌组织苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）心肌组织以4%多聚甲醛固定，常规包埋、切片，行HE染色，观察肾组织病理变化，由高年资病理医师进行心肌细胞的光镜检查。评分分3个部位：右室前乳头肌连同右室前游离壁、室间隔及左室前乳头肌连同左室前壁，最后累积记分。评分标准为：0分，无明显变性、炎症细胞浸润及间质纤维化；1分，散在的小灶性变性、炎症细胞浸润及间质纤维化；2分，局灶状变性、炎症细胞浸润及间质纤维化；3分，广泛的弥漫性变性灶伴大片炎症细胞浸润及间质纤维化。

1.3.3 心肌组织Masson染色心肌组织以4%多聚甲醛固定，常规包埋、切片，Masson染色观察肾组织胶原蛋白沉积，每例切片低倍镜下观察10个互不重叠的肾小管间质视野。计算每张切片心肌间质Masson染色阳性面积占整个视野的百分比，作为心肌胶原蛋白含量的半定量分析。计分标准如下：0分为无着色；1分为轻度，阳性面积＜10%；2分为中度，阳性面积11%～25%；3分为重度，阳性面积26%～50%；4分为极重度，阳性面积＞50%。

1.3.4 TRPM7、TGF-β1的RT-PCR检测①组织总RNA的提取：按照R Neasy Mini Kit试剂盒说明书提取组织总RNA，抽提的总RNA用紫外分光光度计测光密度值，比值为1.9～2.0。取3μl RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，可见5、18和28 S 3条清晰的RNA带，提示RNA无污染和降解。②cDNA的合成：用逆转录试剂盒合成cDNA，再以该cDNA为模板进行RT-PCR反应操作。RT-PCR的引物序列如下，β-actin正向引物：5'-GGCCAACCGTGAAAAGATG A-3'，反向引物：5'-GACCAGAGGCATACAGGGACA A-3'；TGF-β1正向引物：5'-CAACAATTCCTGGCGT TACCTT-3'，反向引物：5'-AAGCCCTGTATTCCGTCT CCTT-3'；TRPM7正向引物：5'-CCGGAATTCCGGAT GAAACCCAAATCCATACCAT-3'，反向引物：5'-CGC GGATCCGCGCTATAACATCAGACGAAGAGAA-3'。③RT-PCR检测：在ABI 7900型荧光定量PCR仪上进行扩增，96孔板加样，设计复孔和标准曲线，用Se-quence Detection System软件分析各检测样本的Ct值（达到一定荧光阈值的循环数），计算2-ΔΔCt，评价TGF-β1和TRPM7在心肌组织中的表达水平。1.3.5心肌组织TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的Western blot检测①心肌总蛋白质的提取。取组织块100 mg加入组织总蛋白提取液1 ml匀浆，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，按Bio-rad蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，取80μl上清加5×变性缓冲液20μl混匀，100℃下变性10 min。②Western blot检测。灌制10%分离胶和4%堆积胶，取总蛋白100μg行上样电泳，电泳结束后260 mA电转印90 min至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。封闭液（5%牛奶）摇床上封闭2 h，加入抗TRPM7（1∶100）、ColⅠ（1∶200）、ColⅢ（1∶200）和β-Actin抗体（1∶100），4℃摇床过夜。洗膜后再加相应的二抗，室温孵育1 h，加ECL液后显影、定影，以β-actin为内参照。将胶片扫描后，采用Quantity One软件分析各条带灰度值，将各目的条带灰度值除以同一标本内参照β-actin条带灰度值得到比值，将该比值除以同一胶片上对照组的比值做为该目的蛋白表达量的半定量结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清Scr、BUN及cTnⅠ水平

模型组大鼠血清Scr、BUN及cTnⅠ水平较对照组明显增高（F=287.122、367.371和90.041，P=0.000）。经DBD治疗后，大鼠血清SCr、BUN及cTnⅠ水平较模型组明显降低（F=87.122、67.371和30.041，P= 0.000、0.002和0.005），差异有统计学意义。经依那普利治疗后，大鼠血清SCr、BUN及cTnⅠ水平较模型组明显降低（F=76.901、69.055和26.621，P=0.000、0.003和0.006），差异有统计学意义。DBD组和依那普利组大鼠血清Scr、BUN及cTnⅠ水平比较，差异无统计学意义（F=0.124、0.102和0.087，P=0.892、0.900和0.963）。见表1。

2.2 心肌组织病理改变

2.2.1 HE染色对照组大鼠心肌纤维排列整齐，结构清晰，细胞质丰富均匀，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央，核仁清晰，未见心肌纤维变性、坏死的病理性改变。模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，部分心肌细胞质强嗜伊红染成深粉红色，细胞核固缩变性，核仁消失，心肌间隔明显增宽，间质纤维化，间质明显水肿，可见淋巴细胞浸润。依那普利组大鼠心肌与模型组比较，病变程度轻、病变范围小，心肌纤维排列尚可，结构清晰，少量心肌细胞质强嗜伊红染成深粉红色，细胞核固缩变性，核仁消失，心肌纤维间隔略增宽，间质轻度水肿，偶见淋巴细胞浸润。DBD组大鼠心肌与模型组比较，病变程度明显减轻、心肌纤维排列清晰，心肌纤维间隔略增宽，间质轻度水肿，偶见淋巴细胞浸润。见图1、2。

表1 各组大鼠血清Scr、BUN和cTnⅠ水平比较（n=8±s）

表1 各组大鼠血清Scr、BUN和cTnⅠ水平比较（n=8±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.01；2）与模型组比较，P＜0.01；3）与依那普利组比较，P＞0.05

组别SCr/（μmol/l）BUN/（mmol/l）cTnⅠ/（ng/ml）对照组23.00±5.625.12±0.240.12±0.05模型组270.54±95.361）52.28±17.251）0.29±0.031）依那普利组108.94±41.322）21.15±15.642）0.21±0.052）DBD组105.81±65.272）3）22.84±19.372）3）0.20±0.062）3）F值87.12267.37130.041 P值0.0000.0020.005

图1 各组大鼠心肌组织病理改变（HE×200）

图2 各组大鼠心肌组织损伤评分

2.2.2 Masson染色普通光学显微镜下观察心肌组织Masson染色切片，心肌细胞呈红色，细胞核呈蓝色，胶原蛋白纤维呈绿色。对照组心肌组织无胶原蛋白沉积；模型组心肌组织可见大量染成绿色的胶原蛋白纤维；依那普利组和DBD组心肌可见少量染成绿色的胶原蛋白纤维。见图3、4。

图3 各组大鼠心肌组织病理改变（Masson×200）

图4 各组大鼠心肌组织胶原蛋白相对面积

2.3 Real-time PCR检测

模型组大鼠心肌组织TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表达较对照组明显增多（F=104.136和167.175，P=0.000）；依那普利组大鼠心肌组织TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表达较模型组减少（F=35.091和45.971，P=0.001和0.000）；DBD组大鼠心肌组织TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表达较模型组也减少（F=49.033和77.175，P= 0.001和0.000），差异有统计学意义。DBD组和依那普利组的TRPM7 mRNA表达比较（F=1.106，P=0.992），差异无统计学意义；TGF-β1mRNA的表达比较（F= 15.274，P=0.041），差异有统计学意义。见表2。

表2 各组大鼠肾组织TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA表达（n=8±s）

表2 各组大鼠肾组织TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA表达（n=8±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.01；2）与模型组比较，P＜0.01；3）与依那普利组比较，P＜0.05

组别例数TRPM7TGF-β1对照组61.00±0.051.00±0.03模型组82.54±1.061）4.32±1.351）依那普利组81.94±1.002）2.29±1.672）DBD组81.91±0.572）1.94±1.032）3）F值49.03377.175 P值0.0010.000

2.4 Western blot检测

模型组TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表达较对照组明显增多（F=173.558、133.098和129.366，P=0.000），差异有统计学意义；依那普利组心肌组织TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表达较模型组减少（F=98.655、87.654和83.781，P=0.001）；DBD组心肌组织TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表达较模型组减少（F=102.687、89.064和90.386，P=0.000、0.000和0.001），差异有统计学意义；依那普利组和DBD组心肌组织TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表达比较（F=1.032、1.028和1.009，P=0.912、0.961和0.985），差异无统计学意义。见图5。

图5 各组大鼠心肌组织TRPM7、ColⅠ及ColⅢ表达的变化

3 讨论

UMF是在慢性肾脏病基础上并发心肌肥大和心室重塑的主要病理基础。瞬时受体电位通道是位于细胞膜上的一类重要阳离子通道蛋白，在心肌成纤维细胞中广泛表达，是心肌成纤维细胞中主要的Ca2+离子通道[3]。TRPM7为TRP家族成员之一，是具有阳离子通道和蛋白激酶双重结构的双功能膜蛋白。TRPM7通过调节细胞内Ca2+平衡，调控成纤维细胞增殖、活化和细胞外基质沉积等，在TGF-β促纤维化作用信号通路中起重要作用[4]。

cTnⅠ是心肌细胞胞浆内的特异性抗原，在正常心肌组织中cTnⅠ均匀分布；在心肌损伤时，cTnⅠ易从心肌细胞中释放入血。

DBD是金元时代李东垣所著《内外伤辩惑论》的经典益气补血方剂，由黄芪和当归以5∶1组成。该方剂在配伍时重用黄芪大补脾肾之气，以资气血生化之源，配以当归苷辛而温，养血和营，黄芪为君，当归为臣。黄芪甲苷是黄芪的主要成分之一，是评价黄芪药材质量的优劣标准，有明确的心肌保护作用。黄芪甲苷能通过下调TGF-β及其下游p-Smad2/3和Smad4的表达，抑制ColⅠ沉积，抑制病毒性心肌炎心肌纤维化形成[5]。阿魏酸为非胍类内皮素受体拮抗剂，是当归的主要有效成份之一，为其活血成分的主要物质基础。阿魏酸具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化作用，拮抗心、肝、肾组织纤维化的形成[6-7]。

DBD的配伍有明确的科学依据。黄芪中的主要成分—黄芪甲苷难溶于水，生物利用度差，而当归中主要成分阿魏酸能明显促进黄芪甲肝在大鼠十二指肠的吸收[8]，同时芪归配比5∶1组阿魏酸析出比例最高；芪归配比5∶1对大鼠免疫功能及抗炎能力改善影响最大[9]。孟立强[10]、MENG[11]、孙丽霞等[12]对黄芪当归的配伍抗纤维化的研究发现，黄芪当归配伍对肝、肾纤维化有多靶点抑制作用。

前期研究表明，DBD含药血清能抑制心肌成纤维细胞的增殖、活化及分泌ColⅠ。利用DBD对自发性高血压大鼠进行早期干预能抑制TGF-β和结缔组织生长因子的表达，改善肾间质纤维化及血管病变。本研究拟在前期研究的基础上，进一步观察DBD对尿毒症大鼠心肌纤维化及心肌组织TGF-β1、TRPM7及胶原蛋白合成的影响。

本研究发现，腺嘌呤核苷酸造模21 d大鼠，Scr、BUN及cTnⅠ较对照组明显升高，心肌间质出现水肿、炎症细胞浸润和纤维化改变。说明尿毒症大鼠肾功能损伤同时伴随心肌损害。经依那普利和DBD治疗后，Scr、BUN、cTnⅠ和心肌损害评分比模型组明显降低，说明DBD和依那普利在改善肾功能的同时对心肌损害也有一定的保护作用。模型组大鼠TGF-β1mRNA、TRPM7 mRNA、TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表达明显增强。说明伴随心肌纤维化损害同时出现TGF-β1、TRPM7表达增强，ECM成分沉积增多，TRPM7表达与心肌纤维化呈正相关。经DBD和依那普利治疗后，上述指标明显降低。DBD治疗组的TGF-β1mRNA表达与依那普利组比较明显降低，说明DBD抑制纤维化主要因子表达的作用优于依那普利。该作用说明中药复合成分的多靶点长时程抗纤维化作用强于肾素-血管紧张素系统抑制剂。肾素-血管紧张素系统抑制剂在纤维化早期的作用要强于纤维化形成期和晚期，该作用与笔者前期在肾间质纤维化中的研究结果一致[13]。DBD能明显改善UMF组织的病理改变，减少心肌组织TGF-β1、TRPM7的表达，减少ECM成分，对UMF起明显的治疗作用。

随着对UMF认识的深入，抗纤维化治疗在UMF的发生中越来越受到重视。TRPM7-Ca2+信号通路的存在为心肌纤维化治疗提供新的策略。DBD配方简单，抗心肌纤维化作用明显，值得进一步临床应用推广。

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（张蕾 编辑）

Effect of Danggui Buxue Decoction on expression of transient receptor potential melastatin 7 and collagen synthesis in myocardial fibrosis tissue of uremia rats*

Lin-na WANG1,Chang-yong CHEN2,Xiao-yong CHEN1, Cun-xia GUO1,Xiang-mei CHEN3
[1.Department of Nephrology,Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou,Henan 450002,P.R.China;2.Department of Radiology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China;3.Department of Nephrology (State Key Laboratory of Kidney Disease),the General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853,P.R.China]

【Objective】To investigate the effect of Danggui Buxue Decoction(DBD)on the expression of transient receptor potential melastatin 7(TRPM 7)and collagen synthesis in rats of uremia myocardial fibrosis (UMF).【Methods】UMF model was induced by gavage of adenine nucleotide.Male Sprague-Dawley rats(n=32)were randomly divided into control group,UMF model group,Enalapril group and Danggui Buxue Decoction(DBD)group.The rats were treated with Enalapril 10 mg/(kg·d）or DBD 6 g/(kg·d）by gastric gavage in the Enalapril group and Danggui Buxue Decoction group,respectively.The rats were treated with identical dose of normal saline in the control and model groups.All the rats were sacrificed on the 21st day.Serum creatinine(Scr),urea nitrogen(BUN)and troponinⅠ(cTnⅠ)were measured.Pathological changes of the myocardial tissue were observed under light microscopy by HE and Masson staining.The expressions of TRPM 7 mRNA and TGF-β1mRNA were detected by real-time PCR.The expressions of TRPM 7,collagenⅠ(ColⅠ)and collagenⅢ(ColⅢ)were detected by Western blot.【Results】Compared with the control group, serum creatinine,urea nitrogen and troponinⅠ,the myocardial tissue pathologial damage index,relative collagen area,the expressions of TRPM 7 mRNA and TGF-β1mRNA and the levels of TRPM 7,ColⅠand ColⅢin the uremia myocardial tissue significantly increased in the model group(P＜0.05).After the treatment by Enalapril and DBD,there were significant reductions in myocardial tissue damage index,relative collagen area and the levels of BUN,Scr and cTnⅠin the Enalapril group and DBD group(P＜0.05).Meanwhile,Enalapril and DBD inhibited the expression of TRPM7 mRNA,TGF-β1mRNA,TRPM 7,ColⅠand ColⅢcompared with the model group(P＜0.05).Compared with the Enalapril group,DBD attenuated the expression of TGF-β1mRNA.【Conclusions】DBD significantly attenuates myocardial fibrosis by supressing the expression of TRPM 7 and then ameliorating collagen deposition.It may be one of the anti-fibrosis mechanisms of DBD in uremia myocardial tissue.

myocardial fibrosis；uremia；transient receptor potential melastatin 7；Danggui Buxue Decoction

1005-8982（2015）30-0007-06

2015-04-22

河南省中医药科学研究专项课题（No：2014ZY02021）

R285；R-332

A