隆突性皮肤纤维肉瘤免疫表型和COL1A1/PDGFB融合基因的临床应用研究

叶新青 邝晓聪 韦常宏 黄俊琪 叶洪涛

·临床研究与应用·

隆突性皮肤纤维肉瘤免疫表型和COL1A1/PDGFB融合基因的临床应用研究

叶新青①邝晓聪②韦常宏①黄俊琪①叶洪涛③

目的：探讨隆突性皮肤纤维肉瘤（dermatofibrosarcoma protuberans，DFSP）诊断中免疫表型和荧光原位杂交（fluores⁃cence in situ hybridization，FISH）检测COL1A1/PDGFB融合基因的应用价值。方法：观察73例DFSP中免疫组织化学标记物vimen⁃tin、CD34、CD99、S100、desmin、SMA和FISH检测COL1A1/PDGFB融合基因的表达。选取85例非DFSP作为免疫组织化学的对照组，10例非DFSP作为FISH检测COL1A1/PDGFB融合基因的对照组。结果：vimentin、CD34、CD99、S100、desmin、SMA在73例DF⁃SP中阳性率分别是100%、91.78%、61.64%、0、0、6.85%，在对照组中不同程度表达，其中CD34的表达在鉴别诊断中有意义。COL1A1/PDGFB融合基因在DFSP的阳性率为86.96%（60/69），对照组均阴性。结论：在DFSP的诊断中，COL1A1/PDGFB融合基因是DFSP较为特异性、敏感性的标记，而CD34是DFSP相对理想的标记。

隆突性皮肤纤维肉瘤 免疫组织化学 FISH COL1A1/PDGFB融合基因

隆突性皮肤纤维肉瘤（dermatofibrosarcoma protu⁃berans，DFSP）是一种发病率较低的低度恶性肿瘤，具有局部侵袭性且易复发［1］。按照WHO新分类，DFSP可以分多个亚型，形态上与多种良恶性软组织肿瘤具有相似性。应用免疫组织化学方法对vimentin、CD99、CD34、S100、desmin、SMA等标记物进行检测是DFSP鉴别诊断的常用手段，但具有重复性；FISH方法对软组织肿瘤进行基因检测对这些免疫表型诊断具有较高特异性和敏感性，但费用较高［2］。本研究通过观察73例DFSP的临床病理特征、免疫组织化学标记物（vimentin、CD99、CD34、S100、desmin、SMA）和COL1A1/PDGFB融合基因的表达，并设置对照组，对结果进行分析总结，探讨其在DFSP诊断中的价值，旨在选择更有效的方法进行病理诊断。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集广西医科大学附属肿瘤医院和广西医科大学附属第一医院及浙江省丽水市中心医院2006年3月至2012年10月诊断为隆突性皮肤纤维肉瘤73例，其中男性42例，女性31例；年龄21～76岁，中位年龄38岁。肿瘤最大径1.5～15.0 cm。另选85例非DFSP，其中纤维肉瘤（fibrosarcoma，FS）31例、纤维瘤病（fi⁃bromatosis）30例、孤立性纤维瘤（solitaryfibroustumor，SFT）24例作为对照组。

1.2 研究方法

所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋，常规制片及免疫组织化学染色。免疫组织化学采用Envision法染色，一抗vimentin、CD99、CD34、S100、desmin、SMA和二抗均购自福州迈新生物技术有限公司。73例DFSP中的69例（其中4例为外院标本，缺乏肿瘤组织未做）和对照组85例非DFSP中的10例（纤维肉瘤3例、纤维瘤病3例、孤立性纤维瘤4例）标本进行FISH检测。FISH所用COL1A1/PDGFB双色双融合易位探针购自德国ZytoVision公司。免疫组织化学判定方法：vimentin、desmin、SMA以胞质棕黄色着色为阳性；CD99、CD34以胞质、细胞膜棕黄色着色为阳性；S100以细胞核棕黄色着色为阳性。染色评分方法按照阳性细胞数所占比例及着色强度分为：无明显阳性细胞为阴性（-），阳性细胞数<25%为弱阳性（+），阳性细胞数25%～50%为中度阳性（++），阳性细胞数>50%为强阳性（+++）。FISH检测结果判定方法：在荧光显微镜下观察并计数50个带有完整信号的间期细胞核，观察红绿信号并计数，正常状态是2个红色信号和2个绿色信号，若15%以上计数的细胞核出现2个或2个以上黄色信号或红绿信号之间距离<2个信号的直径，均表示存在COL1A1/PDGFB基因融合。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件分析，两个样本率的比较用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征

73例DFSP的发病部位：腹壁20例，胸壁10例，肩部5例，大腿7例，臀部5例，前臂3例，腹股沟3例，腰部3例，上臂2例，面部2例，额部3例，腹股沟区2例，锁骨上2例，枕部2例，颈部1例，头顶1例，小腿1例、外阴1例。手术切除局部复发率为21.91%（16/ 73），复发次数最多为8次，复发时间距离手术时间2个月至7年，其中1例术后复发4次并两肺、肝脏、腹腔转移。巨检观察：皮肤真皮内见单个或多个结节，结节与表皮紧密黏连，形状不规则，无包膜，切面灰白色。个别病例肿块不明显，皮肤表面斑片状，质硬，颜色加深。光镜观察：73例DFSP中经典型67例，黏液型3例，纤维肉瘤型2例，色素型1例。经典型DFSP的组织学形态为：真皮内肿瘤组织与表皮之间有一条狭长的细胞稀疏带，部分肿瘤紧贴表皮；肿瘤细胞核短梭形、较纤细，核分裂象不明显，胞质丰富；瘤细胞呈不规则束状、席纹状、车幅状结构排列；肿瘤组织呈蟹足样向深部浸润，浸润至脂肪内可形成特征性的蜂窝样图像（图1A～C）；肿瘤周边无包膜。3例黏液型DFSP可见黏液基质背景中短梭形或星形细胞呈束状排列，黏液样成份分别占50%、70%、90%（图1D）。2例肉瘤样型DFSP为经典型DFSP形态中出现纤维肉瘤区域，即细胞丰富，核异型性明显，可见有较多核分裂象（>4个/10HPF），呈典型的鱼骨样或束状或“人”字形排列（图1E）。1例色素型DFSP为经典型DFSP形态中散在黑色素细胞（图1F）。

图1 隆突性皮肤纤维肉瘤Figure 1 Dermatofibrosarcoma protuberans（DFSP）

2.2 免疫组织化学染色

vimentin、CD34、CD99、S100、desmin、SMA在DF⁃SP、纤维肉瘤、纤维瘤病、孤立性纤维瘤中的表达见表1。其中DFSP中vimentin、CD34、CD99、S100、desmin、SMA阳性率分别为100%、91.78%、61.64%，0、0、6.85%。经统计学分析，CD34和CD99在DFSP与纤维肉瘤和纤维瘤病中表达差异有统计学意义（P<0.05，图2）。其中CD34阳性表达病例中大部分（>90%）为弥漫阳性，少部分（<10%）病例呈弱～中等表达，其中黏液样型黏液区域表达较弱。SMA在DFSP与纤维瘤病和孤立性纤维瘤中表达差异有统计学意义（P<0.05），但SMA的阳性率仅6.85%，为灶状表达。vimentin、S100、desmin在DFSP与纤维肉瘤、纤维瘤病、孤立性纤维瘤中表达差异无统计学意义。S-100蛋白在瘤细胞中呈阴性，色素型DFSP的少量色素细胞胞核S100表达呈弱阳性。

2.3 FISH检测

69例DFSP标本中COL1A1/PFGFB双色双融合探针出现典型的融合信号的阳性率是86.96%（60/69）；非经典型DFSP中黏液型3例，纤维肉瘤型2例，色素型1例均见阳性信号，而对照组非DFSP均为阴性。FISH结果的特异性高于免疫组织化学结果（图3）。

图2 隆突性皮肤纤维肉瘤免疫组织化学染色结果（Envision×100）Figure 2 Immunohistochemical results for DFSP（Envision×100）

表1 隆突性皮肤纤维肉瘤与非隆突性皮肤纤维肉瘤的免疫组织化学结果Table 1 Immunohistochemical results for DFSP and non-DFSP cases

图3 隆突性皮肤纤维肉瘤FISH结果（FISH×1 000）Figure 3 FISH results of dermatofibrosarcoma protuberans（FISH×1 000）

3 讨论

DFSP是一种常见的低度恶性/交界性皮肤纤维组织细胞肿瘤，容易局部复发，但转移率低。任何年龄均可发生，成年人多见，高峰年龄20～50岁，最小的发生于婴幼儿，男性多于女性，病程几个月至数年，以无痛性皮肤肿块为主要症状，但部分病例呈斑块状，皮损特点缺乏特异性［3］。DFSP好发部位主要是躯干，其次是四肢近端和头颈部，罕见于女性外阴、乳腺［4］。该病复发常见，复发次数多者可达10余次，随复发次数增多，复发间隔缩短，肿瘤恶性程度增加，侵袭性明显增强，其中纤维肉瘤样型DFSP的复发次数较多，出现转移的概率更大［5］。本组病例临床特点与文献报道相似，其复发率高达21.91%（16/ 73），其主要原因是肿瘤沿皮下组织呈蟹足样浸润性生长，导致手术切除不净。另外发生于特殊部位或肿瘤体积较大而未能进行标准的手术切除，也成为手术切除后局部复发的重要因素。

DFSP的病理形态除经典型外，还有黏液样型、纤维肉瘤型、色素型、含有肌样结节或肌纤维母细胞样分化型、含有巨细胞纤维母细胞瘤区域样型、萎缩性或斑块样型、硬化样型、颗粒细胞样型、栅栏状和含有较多Verocay小体和伴有大量脑膜上皮旋涡的DFSP等10多个亚型［3］，极易与其他肿瘤混淆，诊断和鉴别诊断非常重要。经典型DFSP的组织学形态是瘤细胞梭形、核纤细，异型性小；排列呈车辐状结构或席纹状图像；表皮萎缩，在表皮与肿瘤之间形成一条狭层的细胞稀疏带，与肿瘤界限清；瘤组织向深部组织蟹足样浸润性生长，以及浸润脂肪组织可形成蜂窝状结构。其他亚型的诊断标准各不相同，但均可见到经典型的形态。其中纤维肉瘤样DFSP诊断应出现纤维肉瘤样改变区域超过肿瘤的5%，即瘤细胞密集，核异型性大，有较多病理性核分裂象（>4个/10HPF），瘤细胞排列成典型的鱼骨样或“人”字形结构［3，5］。黏液样型的诊断标准是黏液样区域必需占肿瘤的50%以上［6］。色素型DFSP又称Bednar瘤［7］，除了经典型DFSP的组织学形态特征外，还可见多少不等的黑色素细胞，易误诊为黑色素肿瘤。萎缩性或斑块样型、栅栏状和含有较多Vero⁃cay小体型、伴有肌样/肌纤维母细胞样分化型、巨细胞纤维母细胞瘤样区域样型、颗粒细胞样型、硬化样型、伴有大量脑膜上皮旋涡的DFSP均较少见，仅见个案报道［8～12］。本组病例严格按照诊断标准分型，可分为经典型67例，黏液型3例，纤维肉瘤型2例，色素型1例。鉴别诊断上，与纤维瘤病、孤立性纤维瘤，纤维肉瘤等形态和免疫组织化学较相近，需要注意鉴别。

免疫组织化学检测是诊断DFSP的重要辅助诊断手段，常用的免疫表型有vimentin、CD34、CD99、S100、desmin、SMA等。据国内外文献报道，CD34的表达率为70%～100%。任晓冰等［13］对72例DFSP进行CD34免疫组织化学检测，结果阳性率87.7%。Palmerini等［14］报道CD34在DFSP阳性率为70%。本研究检测73例DFSP中CD34的表达，阳性率为91.78%，敏感性较高，但与其孤立性纤维瘤中的表达无显著性差异。因此CD34在DFSP中具有较高敏感性，但非特异性。Kazlouskaya等［15］用免疫组织化学方法检测了DFSP和纤维肉瘤中CD99的表达情况，发现DFSP中CD99阳性率为61.76%，呈部分细胞表达或弱表达，而纤维肉瘤病例中阳性率100%，呈弥漫表达或强表达。还发现CD99可以在孤立性纤维性肿瘤、原始神经外胚层肿瘤和分化差的肿瘤中不同程度表达，本研究DFSP中CD99阳性率为61.64%，与孤立性纤维瘤的鉴别无意义，也证实了CD99对诊断DFSP的敏感性和特异性并不理想。本研究在DFSP中检测vi⁃mentin、S100、desmin、SMA结果显示：vimentin敏感性高，但无特异性，对于鉴别诊断无意义；S100、desmin在DFSP中的未见阳性表达，SMA大部分阴性，仅个别病例呈灶性胞质表达，缺乏敏感性和特异性，不能作为阳性标记，但可以作为与神经源性肿瘤、肌源性肿瘤鉴别的阴性指标。提示在DFSP的诊断和鉴别诊断中免疫标记物CD34是一个相对理想的指标，可以作为DFSP的辅助诊断手段。

DFSP发病的分子机制是DFSP中存在17号染色体和22号染色体易位及额外环状染色体，导致17号染色体上的Ⅰ型A1胶原基因（collagen typeⅠa gene，COL1A1）同22号染色体上血小板衍生的生长因子β链基因（platelet-derived growth factor B-chain gene，PDGFB）相融合，发生分子结构重排，产生COL1A1/ PDGFB融合基因，COL1A1/PDGFB融合基因是DFSP特异性、唯一的融合基因，在其他肿瘤中未检测到该基因［16-17］。COL1A1基因和PDGFB基因融合过程中，PDGFB的第1号外显子缺失，被不同片段的COL1A1序列所取代，使PDGFB失去了上游负性调控（PDGFB转录与翻译的抑制序列调控）而引起其克隆性增多，增多的PDGFB可以剌激细胞表面PDGFR表达上调，导致自分泌/旁分泌循环，进一步促进PDGFB的形成；PDGFB可以使蛋白酪氨酸激酶信号通路处于持续激活状态，导致DFSP的发生和发展，酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼可以选择性抑制PDGFRB、ABC和KIT激酶的表达，从而抑制DFSP细胞的增生。因此检测DFSP中COL1A1/PDGFB融合基因的表达对DFSP的诊断有重要价值，同时可为DFSP的伊马替尼靶向治疗提供理论依据［18］。Patel等［19］通过RT-PCR和FISH方法检测COL1A1/PDGFB融合基因在DFSP中的表达，阳性率高达96%。有报道［11］在各种亚型的DFSP，如硬化型、含有巨细胞纤维母细胞瘤样区域样型、色素型、黏液样型、颗粒细胞变性型、纤维肉瘤型等中均可检测到COL1A1/PDGFB融合基因的高表达，与肿瘤类型无关。以上结果显示COL1A1/ PDGFB融合基因具有较高的特异性和敏感性，而且无需考虑DFSP的组织学亚型，为DFSP的诊断提供了更好的方法。本研究应用FISH方法检测COL1A1/ PFGFB融合基因的表达，COL1A1/PFGFB融合基因的阳性率较高（86.96%），其中黏液型、纤维肉瘤型、色素型均阳性，对照组阴性，这也证实了COL1A1/PF⁃GFB融合基因的表达与病理类型无关，具有特异性。因此用COL1A1/PFGFB融合易位探针的检测DFSP中COL1A1/PFGFB融合基因具有较高的诊断应用价值。

总之，DFSP发病率相对较低，是具有高复发性的低度恶性肿瘤，其病理类型多样，形态复杂，需要准确诊断，但诊断中缺乏一种高敏感性且高特异性免疫表型，而CD34是这些表型中相对较为理想的表型。COL1A1/PDGFB融合基因是DFSP的特异性、敏感性基因，用FISH方法检测COL1A1/PDGFB融合基因可作为DFSP诊断的重要手段。

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（2015-09-10收稿）

（2015-10-22修回）

（编辑：邢颖）

Clinical study of molecular markers and COL1A1/PDGFB fusion gene in dermatofibrosarcoma protuberans

Xinqing YE1,Xiaocong KUANG2,Changhong WEI1,Junqi HUANG1,Hongtao YE3

1Department of Pathology,The Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China.2Teaching and Research Section of Pathophysiology,College of Basic Medicine,Guangxi Medical University,Yulin 530021,China.3DepartmentofPathology,Yulin No.1 People's Hospital,Yulin 537000,China.

Objective:To investigate the values of immunophenotype and the Collagen type1 alpha1/Proto-oncogene Proteins c-sis (COL1A1/PDGFB)fusion gene in the diagnosis of dermatofibrosarcoma protuberans(DFSP).Methods:IHC markers and the COL1A1/ PDGFB fusion gene were detected by IHC staining and interphase fluorescence in situ hybridization(FISH)in 73 cases previously diagnosed as DFSP.A total of 85 and 10 non-DFSP cases were also included as controls for IHC staining and FISH,respectively.Results:In the 73 DFSP cases,the positive detection rates for immunohistochemical marker vimentin,CD34,CD99,S100,desmin and SMA were 100%, 91.78%,61.64%,0,0,and 6.85%,correspondingly.Protein expression levels in these cases varied from the control group,and CD34 expression was significantly different among the differential diagnoses.The positive detection rate for the COL1A1/PDGFB fusion gene was 86.96%(60/69),whereas the gene expression in the control group was negative.Conclusion:The COL1A1/PDGFB fusion gene is a highly specific and sensitive marker in the diagnosis of DFSP.CD34 is a suitable marker for DFSP.

dermatofibrosarcoma protuberans,immunohistochemistry,FISH,COL1A1/PDGFB fusion gene

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.21.953

①广西医科大学附属肿瘤医院病理科（南宁市530021）；②广西医科大学基础医学院病理生理学教研室；③广西玉林市第一人民医院病理科

叶洪涛 dr.hongtaoye@goolemail.com

叶新青 专业方向为肿瘤病理诊断。

E-mail：nanningyxq@163.com