丝氨酸蛋白酶抑制因子基因检测在乳腺癌骨髓微转移诊断中的作用*

吴芳兰，范先成，李倩，陈立华，李宁沙，徐丹，危德利

（湖南省长沙市第一医院1.检验科，2.乳腺外科，湖南 长沙 410005）

·临床论著·

丝氨酸蛋白酶抑制因子基因检测在乳腺癌骨髓微转移诊断中的作用*

吴芳兰1，范先成2，李倩1，陈立华1，李宁沙1，徐丹1，危德利1

（湖南省长沙市第一医院1.检验科，2.乳腺外科，湖南 长沙 410005）

目的探讨乳腺癌患者骨髓中丝氨酸蛋白酶抑制因子（Maspin）mRNA的表达及临床意义。方法用荧光定量聚合酶链反应（RTFQ-PCR）检测58例乳腺癌、15例乳腺良性肿瘤及10例健康体检者骨髓中的Maspin mRNA表达，并分析Maspin mRNA表达与临床病理因素的相关性。结果58例乳腺癌患者中，20例Maspin mRNA阳性表达，阳性表达率为35.3%（20/58），显著低于乳腺良性肿瘤患者（86.7%）和健康体检者（90.0%）（P＜0.05）。Maspin mRNA阳性表达与乳腺癌临床分期、腋窝淋巴结转移呈负相关（P＜0.05）；与年龄、肿瘤大小、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）表达无关（P＞0.05）。结论Maspin mRNA可作为检测乳腺癌患者骨髓微转移（BMM）的分子指标之一。BMM检测可为乳腺癌患者的治疗和预后判断提供帮助。

乳腺癌；骨髓；微转移

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，为女性最常见的死亡原因之一。在各种恶性肿瘤中，乳腺癌是治疗效果比较好的一种，但总生存率仍不能令人满意[1]。临床现有的检查，如腋窝淋巴结转移状态（axillary lymphnode state，ALNS）、原发灶大小、肿瘤组织学分级、激素受体状况等尚不能准确地预测肿瘤的复发和转移[2]。许多研究表明，乳腺癌是一个全身系统的疾病，即使早期乳腺癌，也会发生隐匿性转移[3]。如果能在亚临床阶段检测到微小转移灶，则对疾病的分期、治疗、预后有重要意义。

本实验拟分析丝氨酸蛋白酶抑制因子（Maspin）基因检测在乳腺癌骨髓微转移（bone marrow micrometastasis，BMM）诊断中的作用，以指导临床治疗和预后评估。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2010年12月-2014年8月在湖南省长沙市第一医院行手术治疗的乳腺癌女性患者58例。中位年龄46岁。所有患者经病理检查确诊，术前未接受放射及化学治疗，常规检查血清钙、碱性磷酸酶及肝、肾功能，行乳腺钼靶照片、胸片、腹部、盆腔B超及全身发射型计算机断层扫描（emission computed tomography，ECT），以排除远处转移。按照国际抗癌联盟（Union for International Cancer Contro，UICC）2010年肿瘤TNM分期标准：Ⅰ期12例，Ⅱ期29例，Ⅲ期17例。伴有腋窝淋巴结转移35例，无腋窝淋巴结转移23例。按照1982年WHO乳腺肿瘤组织学类型分类标准：浸润性导管癌53例，浸润性小叶癌3例，导管内癌2例。随机选取乳腺良性肿瘤，并排除合并身体其他部位恶性肿瘤的患者15例。其中，纤维腺瘤14例，导管内乳头状瘤1例；年龄16～63岁，中位年龄34岁。健康者（单纯乳腺增生）10例；年龄20～45岁，中位年龄35岁。以15例乳腺良性肿瘤及10例健康者骨髓标本为阴性对照组。本研究得到医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2仪器和试剂

ABI PRISM 7300荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）仪（美国Applied Biosystems公司），连续光谱荧光酶标仪（美国Thermo Electron Corporation公司），Trizol Reagent（美国Invitrogen公司）置于4℃冰箱保存，One Step SYB Prime ScriptTMRT-PCR kitⅡ（大连宝生物工程有限公司）置于-20℃冰箱冷冻保存，PCR引物（大连宝生物工程有限公司）。

1.3研究方法

1.3.1骨髓取样骨髓取样采用三点取材法（双侧的髂嵴和胸骨），取乳腺癌患者及非乳腺癌患者骨髓血进行研究。

1.3.2RTFQ-PCRRTFQ-PCR检测骨髓血中Maspin mRNA。①引物和探针。Maspin mRNA正向引物：5'-CTGACAACAGTGTGAACGACCAGA-3'，反向引物：5'-GACAACGTGGCCTCCATGTTCATC-3'，理论产物166 bp；以18 S rRNA作为内参照，正向引物：5'-ACTCAACACGGGAAACCTCA-3'，反向引物：5'-AACCAGACAAATCGCTCCAC-3'；Taqman荧光探针：5'-CATACCGTCAGTTCTACT-3'。以羧基荧光素作报告集团标记探针5'-，四甲基罗丹明为荧光淬灭集团标记探针3'-。②PCR条件。总RNA抽提后参照大连宝生物工程有限公司的One Step SYB Prime ScriptTMRT-PCR kitⅡ说明书进行逆转录反应，总体积20μl。扩增参数：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。反应结束后仪器自动计算样本中的起始浓度（拷贝/ml）。③结果判断。样本检测结果＜103拷贝/ml的检测下限为Maspin mRNA低表达（阴性），≥103拷贝/ml为高表达（阳性）。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，并行χ2检验和Fisher确切概率法，Maspin mRNA与临床病理特征的相关性选用多因素Logistic回归模型分析，纳入自变量用Enter法，P＜0.05为差异有统计学意义。

附图骨髓标本Maspin mRNA荧光定量扩增图

2 结果

2.1骨髓中Maspin mRNA的表达

本研究构建的RTFQ-PCR检测Maspin mRNA方法特异性较好，熔解曲线未发现非特异性峰，实现定量扩增（见附图）。58例乳腺癌患者骨髓标本中，20例出现Maspin mRNA阳性表达，阳性表达率为34.5%（20/58）。15例乳腺良性肿瘤患者及10例健康者骨髓标本中阳性表达率为86.7%（13/15）和90.0%（9/10），显著高于乳腺癌患者（P=0.000）（见表1）。

表1 乳腺癌、良性乳腺肿瘤及健康体检者骨髓中Maspin mRNA的表达例（%）

2.2Maspin mRNA在乳腺癌患者骨髓中的表达及与临床病理特征的相关性

Maspin mRNA阳性表达与乳腺癌临床分期、腋窝淋巴结转移呈负相关（P＜0.05）；与年龄、肿瘤大小、雌激素受体（estrogen receptor，ER）和孕激素受体（progesterone receptor，PR）的表达无关（P＞0.05）。见表2。

表2 乳腺癌患者骨髓中Maspin mRNA表达与临床病理特征的相关性例（%）

3 讨论

微转移是指采用常规的病理学方法在机体组织、体液及细胞移植物中难以检测到的微量肿瘤细胞，而采用免疫细胞化学法和分子生物学方法可检测到[4-5]。其中最为灵敏的是RTFQ-PCR，其在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过加入已知浓度的标准样本绘制的标准曲线，推算出样本中初始模板的浓度，可定性、定量地检测微量的肿瘤细胞。目前的精度已达到107个细胞中即能找出1个肿瘤细胞。

通过检测肿瘤的微转移来监测肿瘤的发展趋势，在肿瘤可能转移的早期就进行干预，消灭潜在的微转移灶，对提高肿瘤患者的总体疗效和改善预后都有重大的意义。骨髓组织具有分子筛的作用，其血管内皮细胞含有许多肿瘤抗原的受体，能够粘附肿瘤细胞使其滞留在骨髓组织。由于骨髓独特的结构和血流特点，往往是肿瘤细胞血行转移最早到达并聚集成灶的组织，因而骨髓微转移的临床研究已引起广泛关注[6]。

骨髓是肿瘤细胞最易到达的部位，一旦出现就预示已发生远处转移。乳腺癌很易发生骨转移，死于乳腺癌的患者尸检中75%有骨转移。淋巴结与骨髓转移相互独立，检测淋巴结转移阴性患者的骨髓微转移有重要的意义。目前越来越多的资料表明，BMM与乳腺癌的生物学特性关系密切，BMM可以作为一个独立的预后因素。乳腺癌表达某些特异性的标志物，为检测骨髓微转移提供可能[7]。多项研究证实，腋淋巴结转移阴性患者中，骨髓微转移阳性者预后差[8-9]。有研究检测307例患者，81例骨髓微转移阳性者26例复发，226例阴性者34例复发，骨髓微转移阳性者无病生存期和生存率明显下降[10]。BRAUN等[11]用抗细胞角蛋白单抗和免疫组织化学方法分别检测150例淋巴结转移阴性Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者的骨髓及淋巴结微转移。结果发现，骨髓微转移阳性率为29%（44/150），淋巴结转移阳性率为9%（13/150），多因素分析证明，骨髓微转移是独立预后因素，建议以此作为分层因素，选取淋巴结转移阴性患者进行术后化疗。目前，国际上也正在进行这方面的随机研究，以明确其相关性。骨髓微转移有望成为腋窝淋巴结转移阴性者术后化疗的参考依据。

Maspin基因位于染色体18q21.3，其蛋白属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，卵清蛋白亚族，在肿瘤侵袭转移中起重要作用[12]。LELE等[13]研究表明，Maspin在乳腺细胞表达。STATHOPOULOU等[14]用巢式逆转录聚合酶链反应技术对乳腺癌患者Maspin mRNA表达进行研究，认为Maspin mRNA仅在乳腺癌中表达且与细胞角蛋白19 mRNA、癌胚抗原mRNA有相对很高的特异性。近年有研究证明，Maspin mRNA可作为乳腺细胞的特异性标志物[15]，并可能成为乳腺癌治疗的特异性靶标。

本研究结果表明，Maspin mRNA作为乳腺癌骨髓微转移的一项分子检测指标，能反映肿瘤细胞的全身播散状况，可为判断和动态监测病情、指导治疗提供更准确的依据。骨髓中Maspin mRNA的存在能否作为乳腺癌的一项独立预后指标，还有待于扩大样本量和长期随访，收集大量详实的临床资料，进一步明确其应用价值。

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（申海菊 编辑）

Clinical significance of Maspin expression in bone marrow of breast cancer patients*

Fang－lan WU1,Xian－cheng FAN2,Qian LI1,Li－hua CHEN1, Ning－sha LI1,Dan XU1,De－li WEI1
(1.Department of Laboratory Science,2.Department of Breast Surgery,the First Hospital of Changsha,Changsha,Hunan 410005,P.R.China)

【Objective】To evaluate expression and clinical significance of the Maspin mRNA in bone marrow of breast cancer patients.【Methods】The expression of Maspin mRNA was detected by the real－time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RTFQ－PCR)in the bone marrow aspiration from 58 breast cancer patients,with samples of 15 benign breast tumor and 10 healthy volunteers as contro1s.The possible correlation of Maspin mRNA expression with clinicopathologic parameters and related molecular markers were analyzed.【Results】The positive expression of Maspin mRNA was detected by RTFQ－PCR in 20 of the 58 patients with breast cancer.The positive rate was 34.5%,which was much lower thanthat in the patients with benign breast tumor(86.7%)and healthy volunteers(90.0%)(P＜0.05).Maspin mRNA expression was negatively correlated with clinical stage of breast cancer and axillary nodal involvement (P＜0.05),but was not related to age,tumor size,ER or PR status(P＞0.05).【Conclusions】Maspin mRNA may be used as a molecular marker for detection of bone marrow micro－metastasis(BMM)in patients with breast cancer.The results of detecting BMM may have an impact upon therapeutic recommendations and prognostic judgment in breast cancer patients.

breast cancer;bone marrow;micro－metastasis

R737.9

A

1005-8982（2015）32-0045-04

2015-02-15

湖南省科技计划项目（No：2014FJ6050）