白念珠菌线粒体功能缺陷对胞壁结构及毒力的影响

佘晓东高 盈张莉莉沈永年Li Dongmei，2∗刘维达∗

·论著·

白念珠菌线粒体功能缺陷对胞壁结构及毒力的影响

佘晓东1高 盈1张莉莉1沈永年1Li Dongmei1，2∗刘维达1∗

目的: 明确白念珠菌线粒体功能缺陷对菌株细胞壁结构及致病力的影响。方法: 通过透射电镜观察野生株与缺陷株胞壁结构的差异；利用qPCR检测野生株与缺陷株细胞壁成分MNN4、PHR3，常见黏附因子ALS1、ALS3及毒力因子SAP9、SAP10的表达；利用小鼠系统感染模型明确缺陷株与野生株在小鼠致死率及脏器菌载量等方面的差异。结果: 与野生株相比，透射电镜显示缺陷株细胞壁整体结构较为疏松，胞壁较薄，胞壁内外膜境界模糊；qPCR显示缺陷株细胞壁成分、黏附因子、毒力因子表达显著降低；动物模型显示缺陷株无法导致小鼠系统性感染死亡，肝、脾、肾脏器菌载量在接种后第3日明显降低。结论: 白念珠菌线粒体功能缺陷会导致其胞壁完整性，并下调主要胞壁成分及毒力因子的表达，从而导致菌株致病力显著减弱。

白念珠菌； 线粒体； 细胞壁； 毒力

白念珠菌(Candida albicans)属于重要的条件致病性真菌，1除宿主机体免疫力降低等致病因素之外，独特的胞壁结构及毒力因子是其致病的重要因素。白念珠菌线粒体作为菌体能量代谢的重要细胞器，2其功能缺陷势必会引起菌株自身代谢改变并影响菌株活性，本实验拟通过研究白念珠菌线粒体功能缺陷时其胞壁形态、成分及毒力的改变，初步明确线粒体功能变化对白念珠菌致病性的影响，以期进一步了解菌株自身代谢与其致病能力的相关性。

1 材料与方法

1.1 念珠菌培养 标准菌株(SC5314，由中国微生物菌种保藏中心提供)，线粒体功能缺陷株(GOA31，由美国Georgetown University微生物免疫中心惠赠)。菌株于沙堡弱氏固体培养基上进行传代培养，实验前挑单个培养菌落接种于3 mL YPD(0.5%酵母浸膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖)液体培养基中37℃恒温摇床孵育48 h备于实验。

1.2 白念珠菌透射电子显微镜扫描 将YPD液体中

念珠菌离心(3000 r/min，5 min)后用PBS缓冲液清洗3遍，放置于2.5%戊二醛中4℃过夜保存，标本经脱水、包埋、超薄切片、重金属染色后于透射电子显微镜(HITACHI－H7650)下观察胞壁结构及形态变化。

1.3 白念珠菌总RNA提取 念珠菌RNA采用液氮研磨后参照Trizol产品说明书(Life Technologies)用酚、氯仿、异戊醇进行提取经 DNase消化残存的DNA。提取的RNA经Nano drop测定浓度后检测样品浓度以及A260/A280(1.8～2.1)，然后于2%琼脂糖凝胶80V电泳检测提取质量，将质量合格的RNA－80℃保存。

1.4 荧光定量PCR 选取内参C.albicans 18S RNA和胞壁成分因子MNN4、PHR3以及黏附和毒力因子ALS1、ALS3、SAP9、SAP10进行荧光定量PCR检测。选用IDT DNA在线软件设计引物(见表1)。反应体系:2×SYBR Green PCR buffer 12.5 μL、ROX 0.5 μL、primer(5 pmol)1 μL、Template＋ddH2O 11 μL，总体积25 μL；95℃，2 min，接着进行40个循环，95℃，15 s；59℃，1 min。依据2－△△CT法判读结果。

表1 qPCR扩增引物序列

1.5 动物实验 实验用雌性Balb/C纯系小鼠，6～7周龄，扬州大学实验动物中心提供。用无菌生理盐水洗涤白念珠菌，重复3次，用血细胞计数板计数，根据细胞计数结果将白念珠菌细胞调节到1×106个/mL，通过尾静脉注射白念珠菌悬浮液。实验小鼠分为野生株(SC5314)感染模型，缺陷株(GOA31)感染模型。每组13只小鼠，观察21 d，记录每天小鼠存活数量。分别于菌株接种1、2、3 d后每组取1只小鼠处死取肝、脾、肾组织研磨稀释后于YPD培养基中37℃恒温摇床孵育48 h进行菌落(Colony Forming Units，CFU)计数(每个脏器组织做3次涂板计数，取均数)。并取接种2 d后肾脏组织进行病理取材和染色制片，观察真菌侵入程度。

2 结果

2.1 白念珠菌透射电镜扫描 镜下结构显示野生株(图1A)细胞壁整体结构较为完整，胞壁较厚且均匀致密，胞壁内外膜境界清晰。缺陷株(图1B)则表现为胞壁较薄、疏松，胞壁内外膜境界较模糊，尤以内侧膜破坏较重，甚至部分缺失。

图1 白念珠菌野生株(A)与缺陷株(B)透射电镜扫描图(×25k)

2.2 qPCR测定白念珠菌细胞壁成分及毒力因子变化 荧光定量PCR结果显示，缺陷株各检测因子的Ct(Cycle threshold)值较野生株显著改变，从柱状图可以看出，缺陷株较野生株的胞壁成分基因及毒力基因表达整体下调(图2)，下调倍数为2.4～5.8，其中以PHR3和ALS3表达差异最大。

图2 野生株与缺陷株细胞壁成分因子和菌株毒力因子分布

2.3 小鼠系统性感染模型验证菌株毒力变化 野生株接种组小鼠全部于接种后5天内死亡，其中接种后第2天死亡4只，其余均在3～5天内死亡(1～2只/天)；缺陷株接种组未见小鼠死亡(图3)。两组小鼠各脏器菌载量结果显示，肾脏组织菌载量最多，肝脏次之、脾脏最少，野生株接种组菌载量显著高于缺陷株接种组。缺陷株接种组各脏器菌载量在第2天最高，第3天显著降低，野生株接种组未见明显降低(表2)。野生株接种后2天肾脏组织病理示组织内大量菌丝形成，部分菌丝成团并嵌入组织内部(图4A)，缺陷株感染组未见菌丝形成(图4B)。

图3 野生株与缺陷株白念珠菌接种小鼠21天存活率

图4 小鼠尾静脉接种野生株(A)及缺陷株(B)后第2天肾脏组织病理切片图(PAS，×100)

表2 小鼠尾静脉接种白念珠菌后不同脏器CFU计数

3 讨论

线粒体是一种存在于真核细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。因此，线粒体功能变化会从源头上影响整个细胞的能量代谢、营养物质合成。本实验利用线粒体功能缺陷白念珠菌GOA31，对线粒体功能缺陷条件下菌株细胞壁成分合成及毒力因子等关键致病因素的变化进行了验证。

白念珠菌细胞形态的变化是其自身状态的直接体现，其中细胞壁作为白念珠菌和宿主的分界面，参与白念珠菌的黏附，分泌致病性的毒力因子，在引起侵袭性感染的同时还可以通过相应的受体和配体的结合来诱导和调节机体的固有免疫和获得性免疫应答。白念珠菌细胞壁主要包括甘露聚糖、β－葡聚糖及几丁质。其中β－葡聚糖和几丁质是细胞壁的结构成分，甘露聚糖是白念珠菌细胞壁可溶性的具有免疫显性作用物质。3本实验电镜结果显示缺陷株较野生株在细胞壁完整性方面有明显区别，估计与线粒体功能的缺陷影响自身营养物质合成继而影响胞壁结构有关。实验中为进一步明确此推测，我们选取白念珠菌细胞壁中两种最关键的成分甘露聚糖及葡聚糖的代表基因进行荧光定量PCR的检测，结果显示上述两种成分均出现明显表达下降，与电镜结果相互应证，更加肯定了线粒体功能变化对白念珠菌细胞壁结构的影响。

白念珠菌致病时首先黏附宿主细胞，然后通过各种细胞外酶增强毒力侵入宿主形成感染灶。凝集素样序列(Agglutinin－Like Sequence，ALS)和分泌型天冬氨酸蛋白酶(Secreted Aspartyl Proteinase，SAP)作为目前已知重要的白念珠菌黏附及毒力因子，在其致病过程中起到关键作用。其中ALS1在血行播散性鼠感染模型中是重要的毒力因子。4ALS3除了其黏附作用，还作为重要的抗原识别位点诱导上皮细胞对白念珠菌的吞噬，是引起上皮细胞损伤和后续细胞毒作用的关键一步。5在SAP家族中，SAP9和SAP10对维持白念珠菌表面完整性至关重要，在白念珠菌感染患者和携带者中均高表达。6SAP9参与白念珠菌芽管形成，不仅是白念珠菌入侵宿主的毒力因子，也是宿主识别白念珠菌，活化抗感染免疫的诱导因子。7为进一步研究线粒体功能缺陷对菌株毒力的影响，我们通过荧光定量PCR检测了上述4个重要黏附及毒力因子在线粒体缺陷株的表达变化，实验结果显示上述因子在缺陷株表达均明显降低。说明缺陷株在黏附力及侵袭性方面均明显减弱，可能对其侵袭宿主及免疫逃逸造成影响。

动物模型可以模拟、反映真实的机体致病状态，有助于更方便，更有效地认识疾病的发生发展规律。8本实验选用系统性感染小鼠模型为研究对象，直观研究缺陷株对小鼠致病力的改变。结果显示，缺陷株较野生株毒力明显减轻，可能与上述黏附因子及毒力因子表达下降有关。为进一步观察致病菌在小鼠体内的感染情况，我们对各感染小鼠的肝、脾、肾进行菌载量测定及肾脏组织病理学检测。结果在感染的各脏器中，肾脏组织菌载量最高、肝脏次之、脾脏最少，这与其他实验结果类似。9分析原因，估计与各脏器的形态结构、血流状况及免疫反应对念珠菌感染造成的影响不同有关。缺陷株接种小鼠各脏器菌载量在感染后第2天达到高峰，之后明显减少，而野生株组则未见明显变化。肾脏组织病理学检测显示，相对于野生株在肾脏组织内大量菌丝形成并嵌入组织，缺陷株未见明显菌丝形成。说明缺陷株在进入小鼠体内后并没有形成致病性的菌丝相，经过短暂自身繁殖增长后，由于黏附力及毒力的降低逐渐被机体免疫系统清除，因而无法形成系统性感染。但本次实验我们只进行了初步研究，观察时间较短，只检测了通常认为感染最严重时期即接种后3天之内的脏器真菌载量，未能完全研究出致病菌株特别是缺陷株在小鼠体内的感染及清除过程；且动物数量较少，不能完全排除小鼠个体差异对实验的影响，需在后续实验中加大实验动物数量、延长菌载量观察时间，进一步明确整个感染过程。

本实验利用分子生物学及动物模型方法从细胞形态、菌株毒力及致病力方面验证了线粒体功能缺陷对白念珠菌致病性的影响，初步明确了菌株线粒体功能缺陷会导致自身致病力降低，对今后念珠菌感染性疾病控制及抗真菌新药的研发具有一定意义。

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8 Saville SP，Lazzell AL，Chaturvedi AK，et al.Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.Infect Immun，2008，76 (1):97－102.

9 Lionakis MS，Lim JK，Lee CC，et al.Organ－specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis.J Innate Immun，2011，3(2):180－199.

(收稿:2015－01－26)

Effects of Candida albicans mitochondrial dysfunction on cell wall structure and virulence

SHE Xiao-dong，GAO Ying，ZHANG Li-li，et al.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)，Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs，Nanjing，210042

Objective:To determine the effects of Candida albicans mitochondrial dysfunction on cell wall structure，virulence and pathogenicity.Methods:The differences of cell wall structure between the wild－type strain and the deficient strain were observed under transmission electron microscopy.The expression of cell wall components MNN4，PHR3，adhesion factors ALS1，ALS3 and virulence factors SAP9，SAP10 in the wild－type and deficient strain were detected using qPCR.The differences of the fatality rate and organ CFU load between the wild－type and deficient strain were detected in mice system infection model.Results:Compared with the wild－type strain，the deficient strain showed that the cell wall was thinner，the structure was looser and the realm of inner and outer membrane of cell wall was fuzzier under transmission scanning electron microscope.The expression of cell wall components，adhesion factors and virulence factors reduced significantly and there was no mice death in the deficient strain group.The CFU in liver，spleen and kidney of the mice treated with the deficient strain after 3 days reduced significantly.Conclusion:Mitochondrial dysfunction in candida albicans damage the cell wall integrity，reduce the expression of the major cell wall components and virulence factors，resulting in reduction of the pathogenicity of strain.

Candida albicans；mitochondrial；cell wall；virulence

国家自然科学青年基金项目(编号:81401652)江苏省自然科学青年基金项目(编号:BK20130063)

1中国医学科学院、北京协和医学院皮肤病研究所，江苏省皮肤病与性病重点分子生物学实验室，南京，210042 2 Department of Microbiology＆Immunology，Georgetown University Medical Center，Washington DC 20057，USA

∗通信作者