内蒙古汉族人群维生素D受体FokI基因多态性与斑秃的关系

卓 纳张 满辛 燕

·论著·

内蒙古汉族人群维生素D受体FokI基因多态性与斑秃的关系

卓 纳1张 满1辛 燕2∗

目的: 明确维生素D受体FokI基因多态性与内蒙古汉族人群斑秃的相关性。方法: 运用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析(PCR－RFLP)技术，检测105例斑秃患者与145名健康对照的维生素D受体基因FokI酶切位点的多态性。结果: 病例组维生素D受体FokI的3种基因型FF、Ff、ff频率分别为0.324、0.524、0.152，对照组分别为0.297、0.531、0.172，两组间比较无显著性差异(P＞0.05)。结论: 维生素D受体FokI基因多态性可能与内蒙古汉族人群斑秃的发病无关。

斑秃； 维生素D受体； FokI基因多态性

斑秃是一种临床常见皮肤病，我国的患病率为0.27%。1典型表现为头部出现单个或数个边界清晰的圆形脱发斑。斑秃对患者的心理和生活质量均有影响。

维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)启动毛发生长周期，保证各种信号转导通路正常进行并促进毛囊干细胞增殖与分化，在毛发生长中发挥重要作用。2－5近年来学者们发现，6斑秃患者毛囊VDR的mRNA和蛋白表达均降低。VDR的活性和数量直接受VDR基因的调控，VDR基因的改变直接影响VDR生物学功能的实现。FokI作为与个体生长发育有关的VDR的基因多态性位点之一，其异常可导致VDR生物学功能的改变。本研究观察正常对照组及斑秃患者VDR FokI基因多态性的差异，以探讨VDR FokI基因多态性与斑秃的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 入选对象来自内蒙古医科大学附属医院、内蒙古医科大学第三附属医院、内蒙古包头医学院第一附属医院及内蒙古北方重工医院皮肤科就诊的斑秃患者105例(男57例，女48例)。入选标准为经临床确诊的斑秃患者，诊断标准选自Olsen等7制定的斑秃临床诊断指南，入选前2个月内未接受全身糖皮质激素、免疫制剂和放射治疗，排除其他类型脱发，如先天性脱发、生长期脱发、雄激素源性脱发以及瘢痕性脱发。排除伴发有与VDR FokI基因多态性相关的如骨质疏松、佝偻病、铅中毒、前列腺癌、乳腺癌、尿结石等疾病。

病例组患者105例，男57例，女48例，年龄4～66岁，平均35.56±11.82岁。对照组为健康体检人群145名，男75名，女70名，年龄7～64岁，平均37.14± 13.64岁，性别和年龄与病例组比较无统计学差异，与患者无亲属关系，所有健康人群经病史询问及体格检查后排除患病。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 取外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，采用盐析法进行基因组DNA提取。

1.2.2 引物设计 引物序列:上游引物(P1):5′－AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT－3′；下游引物(P2):5′－ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC－3′。

1.2.3 PCR扩增体系与反应条件 PCR反应体系总体积20 μL，DNA模板(150 ng)2 μL，TaqDNA聚合酶(0.5U)0.5 μL，缓冲液10 μL，dNTP 2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL无菌去离子水3.5 μL。

PCR反应条件:94℃预变性2 min，94℃变性，25 s；复性62℃，35 s；延伸72℃ 45 s，35个循环，最后延伸10 min。

1.2.4 酶切体系及其反应条件 取PCR扩增产物10 μL，1 μL FokI限制性内切酶，10×Buffer缓冲液、0.1 BSA缓冲2 μL，去离子水5 μL，37℃水浴3 h。

1.2.5 电泳及结果分析 将2%琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加入足量的l×TBE电泳缓冲液，取20 μL PCR反应产物，加入到2%琼脂糖凝胶的上样孔。90伏恒压电泳，30 min后在紫外凝胶成像分析仪上照相并作标记和存档。分型标准:FF型为265 bp一个片段；Ff型为265 bp，196 bp，69 bp三个片段；基因型ff为196 bp，69 bp两个片段。

1.3 统计学方法 统计学采用SPSS 16.0软件分析。判读样本基因型并计算组内基因型例数，先用Hardy－Weinberg平衡原理估测样本的群体代表性，再统计各组FokI的基因型及等位基因频率，组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR产物酶切结果 经限制性内切酶FokI对PCR产物消化后电泳，显示维生素D受体存在多态性。VDR基因有2个等位基因F和f，可组合形成FF、Ff、ff 3种基因型，见图1。

2.2 Hardy－Weinberg平衡检验 病例组与对照组VDR FokI基因多态性位点经Hardy－Weinberg平衡检验，均无统计学显著差异(均P＞0.05)。这表明，本研究选取的病例组和对照组个体能够代表总体基因型分布规律，见表1。

表1 病例组与对照组VDR FokI基因多态性Hardy－Weinberg平衡检验结果

2.3 维生素D受体基因FokI基因型和等位基因频率分布 病例组VDR FokI基因型和等位基因分布与正常对照组无显著性差异(P＞0.05)，见表2、表3。

图1 VDR基因FokI位点酶切电泳结果

表2 病例组与对照组VDR FokI基因型分布频率比较

3 讨论

维生素D(vitamin D，VitD)为人体必须的一种维生素，为一组脂溶性类固醇衍生物，在紫外线和饮食的影响下在表皮角质形成细胞中合成，直接或间接调节肾及肠道钙、磷代谢，组织细胞增殖、分化和凋亡。这些功能的发挥主要通过VDR介导。VDR是核受体，广泛存在于骨骼、肾、肠道、皮肤等体内大多数组织和细胞，调控机体新陈代谢，也存在于毛囊角质形成细胞和真皮乳头细胞，调控皮肤新陈代谢和毛囊生长周期。

近年的研究发现，VDR在斑秃的发病中发挥着重要作用，其活性与数量的改变直接影响斑秃的发生和发展。斑秃患者毛囊VDR的mRNA和蛋白表达均降低，分析其原因可能为以下几点:(1)VDR使角质形成细胞增殖减慢，分化加快。缺少VDR会减慢角质形成细胞的分化和毛囊的生长，进而发生脱发；5(2)正常足量的VDR缺乏时，阻止β－连环蛋白与Lef1合，Wnt信号通路阻断，导致毛囊发育异常；8(3)结合部位VDR DNA的缺少导致毛发生长周期启动缺陷，导致生长期毛发减少，进而脱发；9(4)VDR敲除小鼠的 T细胞发生明显的炎症反应，学者们推测，VDR的减少诱导毛囊发生炎症反应，使毛囊提前进入退行期，从而发生脱发。10

VDR基因调控VDR mRNA和蛋白表达，VDR的编码基因位于常染色体12q，全长约75 kb，由9个外显子和8个内含子组成。VDR有多个限制性内切酶位点，与个体生长发育及人类疾病相关的基因多态性有4个，分别对应限制性内切酶 FokI、BsmI、ApaI、TaqI的酶切位点。FokI内切酶多态性位点位于VDR基因第2外显子，BsmI、ApaI内切酶多态性位点位于第8和第9外显子之间的内含子内，TaqI位于第9外显子中。这些内切酶多态性都可以影响VDR蛋白的数量和活性。

研究发现，VDR FokI基因多态性因人种和地区的不同出现不同多态性分布。FokI等位基因分布频率在我国汉族人群中的频率分布为F 47%，f 53%，在瑞士高加索人群为F 59%，f 40%，在日本人群中为F 62%，f 37%。郑敏等11报道的广西地区儿童VDR FokI基因型频率为FF 29.85%、Ff 48.13%和ff 22.02%。盛开妍等12报道，我国上海地区汉族人口中FF、Ff和ff基因型频率为40%、48.13%和11.88%。于利伟等13报道的西安地区汉族人口VDR FokI基因型频率为FF 59%、Ff 30%和ff 11%。我们的结果中VDR FokI基因型频率为FF 29.7%，Ff 53.1%，ff 17.2%，与郑敏等报道的广西地区基因型分布频率接近，与盛开妍等报道的上海地区、于利伟等报道的西安地区分布频率略有不同。

我们的研究显示，内蒙古地区汉族人群VDR基因FokI基因多态性与斑秃无相关性，这与Akar等14对土耳其白种人25例斑秃和27例对照组进行的研究结果相一致。

1王婷琳，沈佚葳，周城，等.中国六城市斑秃患病率调查.中华皮肤科杂志，2009，42(10):668－670.

2 Lim YY，Kim SY，Kim DS，et al.Reduced expression of Vitamin D receptor(VDR)related to alopecia universalis by Wnt/b－catenin signaling pathway(Abst).Exp Dermatol，2010，19: 576.

3 Teichert A，Elalieh H，Bikle D，et al.Disruption of the hedgehog signaling pathway contributes to the hair follicle cycling deficiency in Vdr knockout mice.J Cell Physiol，2010，225(2):482－489.

4 Bikle DD.Vitamin D and the skin.J Bone Miner Metab，2010，28(2):117－130.

5 Luderer HF，Demay MB.The vitamin D receptor，the skin and stem cells.J Steroid Biochem Mol Biol，2010，121(1－2):314－316.

6蔡泽明，张斌，赵莹，等.维生素D受体在斑秃皮损处毛囊的异常表达.广东医学，2011，32(10):1259－1262.

7 Olsen EA，Hordinsky MK，Price VH，et al.Alopecia areata investigational assessment guidelines－Part II.National Alopecia Areata Foundation.J Am Acad Dermatol，2004，51(3):440－447.

8 Cianferotti L，Cox M，Skorija K，et al.Vitamin D receptor is essential for normal keratinocyte stem cell function.Proc Natl Acad Sci，2007，104(22):9428－9433.

9 Sakai Y，Demay MB.Evaluation of keratinocyte proliferation and differentiation in vitamin D receptor knockout mice.Endocrinology，2000，141(6):2043－2049.

10 Froicu M，Weaver V，Wynn TA，et al.A crucial role for the vitamin D receptor in experimental inflammatory bowel diseases.Mol Endocrinol，2003，17(12):2386－2392.

11郑敏，罗建明.广西地区儿童维生素D受体基因Fok工位点多态性分布研究.临床儿科杂志，2010，28(11):1061－1063.

12盛开妍，张薇薇，游利，等.上海地区汉族人群维生素D受体基因多态性与1型糖尿病的相关性研究.中国糖尿病杂志，2009，17(9):666－668.

13于利伟，王世捷，郭建新，等.西安地区青少年骨密度值及其与维生素D受体基因多态性的研究.西安交通大学学报(医学版)，2005，29(l):115－117.

14Akar A，Orkunoglu FE，Ozata M，et al.Lack of association between Vitamin D receptor FokI polymorphism and alpopecia areata.Eur J Dermatol，2004，14(3):156－158.

(收稿:2014－08－14 修回:2014－08－24)

Relationship between vitamin D receptor gene FokI polymorphism and alopecia areata in Inner Mongolian Han population

ZHUO Na，ZHANG Man，XIN Yan.Affiliated Hospital of Inner Mongolian Medical University，Inner Mongolian，Hohhot，010050

Objective:To determine the relationship between the polymorphism of vitamin D receptor gene FokI and alopecia areata in Inner Mongolia Han population.Methods:The polymorphism of vitamin D receptor Gene FokI sites in patients with alopecia areata(105 patients)and healthy controls(145 patients)were detected by PCR－RELP.Results:The genotype frequencies of FF，Ff and ff in patients were 0.324，0.524，0.152 and those in healthy controls were 0.297，0.531，0.172.There were no significant difference between the patients and the controls(P＞0.05).Conclusion:There is no relationship between the polymorphism of vitamin D receptor FokI and alopecia areata in Inner Mongolia Han population.

alopecia areata；vitamin D receptor；FokI polymorphism

1内蒙古医科大学附属医院皮肤科，内蒙古呼和浩特，010050 2内蒙古医科大学第三附属医院皮肤科，内蒙古包头，014010

∗通信作者