不同亚型天疱疮患者血清对HaCaT细胞桥粒芯糖蛋白3表达的影响

李 惠林 麟张洁尘冯素英周武庆弓娟琴王宝玺

·论著·

不同亚型天疱疮患者血清对HaCaT细胞桥粒芯糖蛋白3表达的影响

李 惠1，2林 麟1∗张洁尘1冯素英1周武庆1弓娟琴1王宝玺1

目的: 确定3例不同亚型天疱疮患者(寻常型、副肿瘤型和落叶型天疱疮)血清对HaCaT细胞桥粒芯糖蛋白1、3(DSG1、3)及mRNA表达的影响。方法: 采集3例患者血清，ELISA测定抗DSG1抗体和抗DSG3抗体；血清培养HaCaT细胞，直接免疫荧光检测细胞表面DSG1、3荧光强度，qPCR测定DSG3 mRNA的表达。结果: 寻常型天疱疮患者血清抗DSG1抗体及抗DSG3抗体均阳性，副肿瘤型天疱疮患者血清抗DSG3抗体阳性，落叶型天疱疮患者血清抗DSG1抗体阳性。3例患者血清分别作用后，HaCaT细胞表面DSG3荧光强度均降低；寻常型及副肿瘤型天疱疮患者血清作用后，HaCaT细胞DSG3 mRNA表达增加，落叶型天疱疮患者血清作用后，HaCaT细胞DSG3 mRNA表达降低。结论:抗DSG1抗体血清可以降低DSG3表达；抗DSG3抗体血清可以增加细胞中DSG3的表达，但血清中的抗DSG3抗体存在以及KC细胞对DSG3的内吞等作用会将其表达的蛋白减少。

HaCaT细胞； 桥粒芯糖蛋白3； 天疱疮

天疱疮是已被公认的抗钙黏素自身免疫性疾病。该病的发生与机体产生致病性抗桥粒芯糖蛋白(Desmoglein，DSG)1及抗DSG3为代表的抗桥粒成分自身抗体有关。目前已研究显示不同DSG抗体可以导致临床不同类型天疱疮，如自身抗原为DSG1有天疱疮与流行性落叶型天疱疮；自身抗原为DSG3黏膜主导型寻常型天疱疮；自身抗原为DSG1与DSG3的有黏膜皮肤型寻常型天疱疮、药物诱导天疱疮及副肿瘤天疱疮。目前DSG补偿及空间效应理论即DSG途径被大多数研究者认可，DSG补偿理论认为同一细胞表面同时表达的DSG1、DSG3可以互相补偿对方的功

能不足，空间效应理论认为自身抗体与DSG(主要为N端)结合所致空间效应阻碍细胞间DSG黏附作用。但是这两种理论是如何引起角质形成细胞(Keratinocyte，KC)出现棘层松解的病理生理学机制，目前并没有详细的阐述。为探讨抗DSG1抗体及抗DSG3抗体对KC的影响，我们进行如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清与细胞来源 本研究经中国医学科学院皮肤病研究所伦理委员会批准患者及正常对照签署知情同意书后采集血液标本。所采集的患者符合天疱疮临床诊断标准:(1)临床表现为皮肤或黏膜有松弛性水疱；(2)皮肤组织病理学改变为表皮内水疱；(3)皮肤活检直接免疫荧光结果为免疫球蛋白(Ig)G在表皮内呈网状沉积，同时满足(4)；(4)未经系统糖皮质激素和免疫抑制剂治疗。正常对照取自于未患皮肤疾病的正常成人。实验涉及的HaCat细胞系源于中国医学科学院皮肤病研究所中心实验室。

1.1.2 主要试剂及仪器 细胞培养产品购于南京凯基生物科技发展有限公司及美国Life Technologies公司。抗DSG1、3自身抗体 ELISA试剂盒购于日本MBL公司。DSG3一抗购于美国 Santa Cruz公司。FITC标记二抗均购于美国Jackson公司。FluoViewTMFV1000激光共聚焦显微镜购于日本Olympus公司。RNA提取试剂TRIzol购于美国Life Technologies公司。逆转录试剂盒购于美国Thermo Fisher Scientific公司。qPCR试剂盒购于普洛麦格生物技术有限公司。qPCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 qPCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 血清采集及血清抗体滴度测定 取患者及正常成人上肢静脉血20 mL，静置4℃冰箱2 h后，4℃低温离心机 ×300 g离心 10 min；ELISA法应用抗DSG1、抗DSG3自身抗体测定试剂盒测定不同患者血清中抗DSG1、抗DSG3抗体滴度。

1.2.2 HaCaT细胞系的复苏与培养 从液氮容器中取出HaCaT细胞冻存管，迅速置于37℃水浴锅中，并不时摇动并变换位置，使冻存管中的冻存物在1 min之内融化。融化后转移细胞悬液到离心管，1000 rpm (×179 g)离心4 min，弃去上清液。10%胎牛血清－DMEM培养液重悬细胞，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。次晨更换一次培养液，并观察生长情况；继续培养，隔日换液。

1.2.3 天疱疮患者血清培养HaCaT细胞 HaCaT细胞培养至80%满时传代，待细胞融合50%～60%，加入PBS清洗细胞后更换为含50%不同来源患者血清的DMEM培养基，正常对照以含50%正常血清的DMEM培养基代替。24 h后，倒置显微镜下观察HaCaT细胞集落形成与集落融合的情况并进行直接免疫荧光染色。

1.2.4 直接免疫荧光测定HaCaT表面DSG3表达取出1.2.3步培养后HaCaT细胞爬片，加入新鲜配制的4%多聚甲醛固定细胞10 min。PBS清洗3遍，每次5 min。加入2%牛血清白蛋白PBS封闭30 min。加入抗DSG3抗体室温孵育1 h；加入二抗后室温孵育45 min；加入7.5 μg/mL Hoechest33342染色10 min标记细胞核，激光共聚焦显微镜下观察DSG3蛋白荧光强度。空白对照以PBS代替一抗，余操作同。

1.2.5 qPCR测定HaCaT细胞DSG3 mRNA表达TRIzol法提取RNA，蛋白核酸分析仪测定RNA浓度，要求A260/280 nm值为1.7～2.0。依据逆转录试剂盒说明合成反转录脱氧核糖核苷酸(cDNA)；依据qPCR试剂盒说明qPCR扩增目的条带(表1)。

1.3 图像采集及数据处理与分析 采用Thermal cycler’s软件包计算的Ct值用来分析荧光强度。2－Ct代表相应的相对表达量。数据以SPSS 18.0软件包进行统计分析。计量资料以 ¯x±s统计描述，以One－Way ANOVA进行统计推断；数据统计图以 GraphPad Prism 5绘制。

2 结果

2.1 不同亚型天疱疮患者血清抗 DSG1抗体、抗DSG3抗体滴度测定 本研究共收集3例患者血清标本，均符合天疱疮临床诊断标准且未经系统治疗。3例患者为2女1男，患者A 45岁，病史8年，临床诊断为寻常型天疱疮，就诊时皮损主要位于口腔，躯干散在少量。患者B为15岁，病史15天，临床诊断为副肿瘤天疱疮(具体肿瘤不详)，皮损主要累及口腔及四肢，躯干散在。患者C 62岁，病史1年，临床诊断为落叶性天疱疮，皮损主要表现为全身反复红斑水疱、糜烂、结痂、脱屑。正常对照为29岁健康女性。收集3例患者及正常对照血清后，以ELISA法测定血清中抗DSG1、抗DSG3抗体滴度，结果显示患者A血清抗DSG1抗体及抗DSG3抗体均阳性，患者B血清抗DSG3抗体阳性，患者C血清抗DSG1抗体阳性，对照血清抗DSG1抗体及抗DSG3抗体均阴性(表2)。

表2 不同血清中抗DSG1抗体、DSG3抗体滴度

2.2 天疱疮患者血清对HaCat细胞集落形成的影响

为研究含有不同抗体的患者血清对HaCaT细胞的集落形成的影响。对照组显示，血清作用前后，未见集落形态明显变化，细胞集落周围分界不明显，细胞边界不清晰，集落间融合连续。患者血清作用24 h组，均出现细胞集落“收缩”，集落间分界明显，集落边缘清晰、融合不连续。不同血清影响下的HaCaT细胞形态差异不明显(图1)。

图1 不同亚型天疱疮患者血清作用24 h对HaCaT细胞集落形成的影响

2.3 不同亚型天疱疮患者血清影响HaCaT细胞表面DSG3表达 为观察不同亚型天疱疮患者血清对HaCaT细胞 DSG3的影响，血清作用后，DIF测定DSG3荧光强度改变情况。图2所示，应用A、B、C及对照血清与HaCaT细胞共培养24 h后，免疫荧光显示对照组中细胞体DSG3荧光强度高，尤其在细胞连接处最高。而A患者血清作用后HaCaT细胞出现胞体部DSG3荧光弱阳性，连接处荧光强度较对照组降低。B患者血清与细胞共培养后，HaCaT细胞表面DSG3荧光呈阳性，部分细胞连接处强阳性荧光；C患者血清与细胞共培养后，HaCaT细胞表面DSG3荧光亦呈阳性，平均荧光强度高于B患者血清处理后细胞，但未见局部强阳性荧光。

2.4 不同亚型天疱疮患者血清影响 HaCaT细胞DSG3 mRNA表达 血清共培养作用后，以qPCR测定各组DSG3 mRNA改变情况，结果组间出现明显差

异(P＜0.01)。如表3及图3所示，A患者血清与HaCaT细胞共培养后DSG3 mRNA相对表达量较对照组高152.7%，B患者血清作用后高172.9%，C患者血清作用后则降低为33.9%；A、B患者血清作用后出现的DSG3 mRNA增高具有显著意义(P＜0.01)。C患者血清作用后的DSG3 mRNA降低较对照组及A、B两组均出现显著差异(P＜0.01)。

图2 不同亚型天疱疮患者血清作用24 h后HaCaT细胞表面DSG3表达

图3 不同亚型天疱疮患者血清与HaCaT细胞共培养后DSG3 mRNA表达

表3 不同亚型天疱疮患者血清与HaCaT细胞共培养后DSG3 mRNA相对表达量

3 讨论

本研究发现含抗DSG3抗体的寻常型及副肿瘤型天疱疮患者血清可以降低KC DSG3荧光强度，这一结果和Lanza等1研究相似，他们发现抗体量达到l mg/mL可以导致DSG3表达量降低及棘层松解的形成，但本研究由于部分限制并未严格定量。这种荧光强度的降低可能与自身抗DSG3抗体与KC表面抗原位点结合后阻碍外源抗体结合2有关，还有可能与自身抗DSG3抗体优先与成熟DSG3结合3有关，上述反应的结果即表现为实验中种属特异性一抗及荧光二抗的结合量降低。造成KC表面DSG3荧光强度降低这一结果，还有可能是自身抗DSG3抗体与KC结合后导致KC表面DSG3的快速枯竭所致。研究发现，抗DSG3自身抗体结合KC表面DSG3后，可以通过介导KC对DSG内吞4使得KC细胞表面DSG3快速枯竭，而p38 MAPK途径的激活参与可这种KC内吞作用，5因为抑制P38可以阻止自身抗DSG3抗体介导的KC内吞过程。4还有研究发现网格动力系统所诱导的KC细胞骨架重组6也可以直接参与内吞过程。DSG3抗体的快速枯竭原因之二可能与DSG3在自身抗体作用后的裂解7及易溶解有关，而这一途径也通过MAPK通路参与。4也有研究者认为蛋白激酶C(PKC)也参与影响DSG3表达，PKC的参与可能是通过钙诱导PKC介导的KC的分化8以及PKC同工酶的差异表达所致黏附分子的分化依赖性差异表达有关。9抗DSG3抗体诱导的细胞凋亡过程也有可能导致DSG3降低，因为抗DSG3抗体促进procaspase－3、Bax、Bcl－2、uPAR，白细胞介素－1β、白细胞介素－6及肿瘤坏死因子－α等细胞凋亡及大量炎症因子释放，2而细胞凋亡过程中基质金属蛋白酶9可以参与DSG3降低。10另外天疱疮抗体黏附所致蛋白相关蛋

白酶敏感性增加，也可能与细胞表面的DSG3表达量降低相关。

本研究还发现抗DSG1血清作用可以降低DSG3的可识别含量，这一结果与Schulze等11结果相同。抗DSG1抗体可能通过可以交叉识别DSG312从而覆盖抗原表位并诱导DSG3的细胞内吞作用和/或激活p38MAPK13参与DSG3内化等有关。本研究还发现抗DSG1抗体血清可以降低DSG3 mRNA、抗DSG3抗体的血清可以增加DSG3 mRNA表达，这一作用可能机制有:(1)KC的负反馈作用；(2)抗DSG1抗体触发PKC信号通路变化14－16引起DSG3 mRNA表达降低；(3)或者与患者血清中存在其他抗体激活了相关通路有关。

综上所述，抗DSG1抗体血清(落叶型天疱疮患者血清)可以在转录及翻译水平降低DSG3表达；含抗DSG3抗体血清(寻常型天疱疮及副肿瘤型天疱疮)可以在转录及翻译水平增加DSG3表达，但抗DSG3抗体所致的蛋白翻译的增加会被血清中的的抗DSG3抗体以及KC细胞对DSG3内吞等作用所消耗或抵消。需要指出的是，由于副肿瘤天疱疮(如患者B)一类患者体内往往有针对多种自身抗体，且抗体类型除IgG外，还包括IgA、IgM等，但因本研究的时间及技术限制，未能将血清中的各种亚型及亚类自身抗体进行分离，此为本研究之局限所在，下一步将展开详细研究。

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(收稿:2014－08－01 修回:2014－09－25)

Effects of serum from different subtypes of pemphigus on the expression of desmoglein－3 in HaCaT cells

LI Hui，LIN Lin，ZHANG Jie-chen，et al.Institute of Dermatology，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Nanjing，210042

Objective:To determine the effects of serum from 3 patients with different subtypes of pemphigus(pemphigus vulgaris，pemphigus foliaceus and paraneoplastic pemphigus)on the expression of desmoglein－3 and mRNA in HaCaT cells.Methods:The levels of anti－DSG1 and anti－DSG3 autoantibodies from patients’serum were detected by ELISA.HaCaT cells were cultured in serum－DMEM culture.The content of DSG3 protein on HaCaT cells were detected by direct immunofluorescence and DSG3 mRNA were detected by qPCR.Results:ELISA showed positive of anti－DSG1 and anti－DSG3 autoantibodies in the patient with pemphigus vulgaris，positive of anti－DSG3 autoantibodies in the patient with paraneoplastic pemphigus and positive of anti－DSG1 autoantibodies in the patient with pemphigus foliaceus.The fluorescence intensity of DSG3 on the surface of HaCaT cells was decreased in the three patients after separately cultured with the sera of the three patients.The content of DSG3 mRNA in HaCaT cells was increased after cultured with serum of the patients with pemphigus vulgaris and paraneoplastic pemphigus.The content of DSG3 mRNA in HaCaT cells was decreased after cultured with serum of the patient with pemphigus foliaceus.Conclusion:The serum containing anti－DSG1 antibodies decreased the expression of DSG3 mRNA.The serum containing anti－DSG3 antibodies increased the expression of DSG3 mRNA but the protein of DSG3 was decreased because of the endocytosis of keratinocytes and existence of anti－DSG3 antibodies in the serum.

HaCaT cells；desmoglein 3；pemphigus

国家自然科学基金(编号:81071295)卫生公益性行业科研专项经费项目(编号:201002016)北京协和医学院协和青年科研基金(编号:2012J13)

1北京协和医学院＆中国医学科学院皮肤病研究所，南京，210042 2北京大学深圳医院皮肤科，深圳，518000

∗通信作者