许 辉 马 红 闵 敏 顾文涛 李遇梅
尖锐湿疣皮损中p16基因启动子区高甲基化及其mRNA的表达
许 辉 马 红 闵 敏 顾文涛 李遇梅∗
目的: 明确尖锐湿疣组织中p16基因启动子区高甲基化与p16 mRNA表达的关系。方法:采用甲基化特异性PCR技术检测30例尖锐湿疣组织及20名正常对照组织p16基因启动子区CpG岛甲基化状态,用RT-PCR法检测p16 mRNA的表达。结果: 尖锐湿疣组织p16基因启动子高甲基化率为26.67%(8/30),正常对照组高甲基化率为0,差异具有统计学意义(P<0.05)。高甲基化的尖锐湿疣组织p16 mRNA的表达高于未甲基化的尖锐湿疣组织p16 mRNA的表达和高于正常对照组织p16 mRNA的表达。结论: 尖锐湿疣组织皮损中p16基因启动子区甲基化不导致p16 mRNA表达的缺失。
尖锐湿疣; 人乳头瘤病毒; 甲基化; p16
尖锐湿疣(CA)是由人乳状瘤病毒感染引起的上皮增生性病变,为重要的性传播疾病之一。p16基因是参与细胞周期调控的抑癌基因,主要能与cyclinD竞争性结合CDK4/6而抑制CDK4/6激酶的活性使pRb不能磷酸化,使未磷酸化的pRb增加而抑制细胞增殖。p16基因失活使p16/pRb调节通路异常,致使细胞过度增殖,其主要失活机制有基因突变、纯合性缺失和启动子甲基化。其中启动子CpG岛甲基化是导致p16基因失活的重要原因,是近年来研究的热点。
国内外的研究p16基因在CA患者组织中表达存在异常。因此我们用甲基化特异性PCR技术和RTPCR法检测30例CA患者组织中p16基因启动子甲基化异常及其mRNA的表达,研究CA患者中p16基因甲基化的改变及与p16 mRNA表达的关系,以及其在CA发生发展中的作用。
1.1 材料 30例CA标本均来自江苏大学附属医院皮肤科2011~2012年新鲜手术切除标本(标本来自肛周及外生殖器部位),标本离体后,在无菌条件下迅速放入液氮速冻并转至-80℃超低温冰箱冻存。另选择20名正常人包皮组织标本用作正常对照。CA患者术前均未接受任何治疗,30例组织标本中男20例,女10例,年龄24~60岁,平均36.2±8.3岁。经组织病理诊断为CA(图1);20名正常对照均为正常包皮组织,无皮炎湿疹等皮肤病。
1.2 组织DNA及RNA提取 把冷冻组织磨碎成粉末状,放入1.5 mL Ep管中,用组织DNA提取试剂盒(Cat.No 53106,TAKARA公司)及 RNA Trizol(Invitrogen)提取组织DNA及RNA,紫外分光光度计测定纯度,A260/A280比值为1.8~1.9,4℃保存。
1.3 甲基化检测分析
1.3.1 亚硫酸氢盐修饰按ZYMO RESEARCH公司EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒进行甲基化修饰。
1.3.2 甲基化特异性PCR扩增 p16基因甲基化引物序列为5′-TTATTAGAGGGTGGGGCG2GATCGC-3和CCCGAACCGCGACCGTAA-3′;非甲基化引物序列为5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′5'-
CAACCCCAAACCACAACCATAA-3′,1分别用于扩增p16基因启动子区CpG岛甲基化和非甲基化的等位基因;扩增产物长度分别为150 bp和151 bp。PCR反应体系为50 μL,包括1×PCR缓冲液,1.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/ L dNTP,引物各10 pmol,1U Taq DNA聚合酶,50~100 ng模板 DNA。PCR循环参数:297℃预变性5 min,97℃ 1 min,甲基化和非甲基化扩增的退火温度分别为65℃和60℃ 1 min,72℃ 1 min,35个循环后,72℃延伸 7 min。PCR扩增时以正常人包皮组织DNA作正常对照,以等量灭菌双蒸水代替模板DNA作阴性对照。
1.4 实时定量PCR扩增应用Formantas逆转录试剂盒操作说明书操作逆转录获得cDNA第一条链。按照SYBR Green Pefect Real Time试剂盒(TaKaRa)操作说明书进行PCR扩增。引物序列及反应条件如下,p16:正链:GGCACCAGAGGCAGTAACCA,反链: GGACCTTCGGTGACTGATGATCTAA,片段长度为120 bp。GAPDH:正链:GAAGGTGAAGGTCGGAGCT,反链:GAAGATGGTGATGGGATTTC,片段长度为 226 bp。扩增曲线反应条件为95℃20 s,1个循环;95℃5 s,60℃ 20 s,40个循环;溶解曲线反应条件为95℃ 30 s,56℃ 1 min,95℃ 30 s。总反应体积为20 μL,扩增产物在MX3000P仪上分析。
1.5 结果分析 DNA PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭显色观察。RT-PCR产物根据所得的Ct值,利用公式2-ΔCt得到目的基因的定量值。
1.6 统计学方法 根据数据类型选择卡方检验和t检验,所有数据均在SPSS 15.0软件包中进行分析。
2.1 p16基因启动子区CpG岛甲基化状况 以亚硫酸氢钠修饰后的基因组DNA为模板,用PCR对p16基因启动子区CpG岛高甲基化进行检测,甲基化和非甲基化扩增产物分别为150 bp和151 bp(图2)。结果表明30例CA组织中有8例高甲基化(8/30,26.67%),正常对照组均未见高甲基化。CA p16基因高甲基化率高于正常对照组(χ2=4.52,P<0.05,表1)。
2.2 p16 mRNA的表达 30例CA中22例非高甲基化患者p16 mRNA表达0.95±0.06高于20例正常对照0.68±0.10,P<0.05,8例高甲基化患者中p16 mRNA的表达1.08±0.09明显高于于正常对照组0.68± 0.10,P<0.01和未甲基化组0.95±0.06,P<0.05,表2。
2.3 p16基因启动子高甲基化与p16 mRNA表达的关系 30例CA组织中有8例(8/30,26.67%)存在基因启动子高甲基化,22例未甲基化,30例CA组织中均没有p16 mRNA的失表达。p16基因高甲基化未导致p16 mRNA表达的缺失。
表1 CA组和正常对照组甲基化率的比较
表2 CA组和正常对照组p16 mRNA表达水平
p16基因定位于人9号染色体短臂2区1带(9P21),能抑制细胞分裂、增殖。以往研究已证实,HPV感染皮肤黏膜后产生早期蛋白E7,它与宿主细胞的Rb相结合,导致Rb基因功能失活,失去对p16的负反馈抑制,致使p16蛋白过度表达。1本实验30例CA中22例非高甲基化患者p16 mRNA表达高于20名正常对照,8例高甲基化患者中p16 mRNA的表达也明显高于于正常对照组,与以往的研究结果一致。2
甲基化是指DNA在甲基转移酶(DNMTS)催化下,由S腺苷蛋氨酸提供甲基,胞嘧啶的5’位碳上加上一个甲基基团,形成5’位胞嘧啶(5’MC),是除缺失与突变之外的另一种调控基因表达的机制。p16基因是甲基化的靶基因。相当数量的报道发现肺癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌患
者中都存在p16基因的甲基化状态异常。也有研究表明p16甲基化状态与某些肿瘤,如卵巢癌,恶性间皮瘤的预后有关。李遇梅,崔盘根等的实验结果表明SLE患者p16基因呈高甲基化状态。3,4夏永华等的研究发现p16启动子甲基化与银屑病角质形成细胞过度增殖有关,且与病期有关。5有些研究报道p16基因启动子区高甲基化状态与p16蛋白表达呈明显负相关。6,7而在脂肪肉瘤8及巴雷特氏食管以及食管腺癌9的研究中发现,p16的高甲基化与p16 mRNA的表达水平无明显的相关性。我们通过甲基化特异性PCR研究表明,30例 CA患者中,甲基化阳性率26.67%(8/30),非甲基化率73.33%(22/30),较正常对照组有统计学差异。故推测CA患者组织中存在p16基因启动子区的高甲基化。而本实验也检测了p16 mRNA的表达,但结果显示p16 mRNA的表达增高,与DNA高甲基化之间无负相关性。因此我们推测CA患者中存在p16启动子区高甲基化,但是一方面HPV E7与Rb结合失去了对p16的负反馈抑制,另一方面由于遗传以及表观修饰学的不稳定,CA患者组织皮损中p16基因启动子区高甲基化不影响p16的表达。
CA是生殖道常见的性传播疾病,发病有增加趋势,目前已成为发病率第二的性传播疾病。CA多为低危型HPV感染,与HPV6、11型关系尤为密切。但部分感染低危型HPV的CA仍有发生癌变的可能。10在HPV相关的宫颈癌和其它生殖道疾病的研究中报道p16蛋白过表达与其基因突变和重排的关系不大,但与p16基因CPG岛异常甲基化有密切关系,甲基化是宫颈癌发生的早发事件。Kim等发现随着宫颈病变进展p16甲基化率与p16阳性表达率均升高。11本实验发现30例CA组织中有8例高甲基化,并且这8例高甲基化患者中p16 mRNA的表达明显高于正常对照组,这8例p16高甲基化的CA患者疾病的发展转归还需要进一步随访及观察。
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2李亚婷,王克玉.尖锐湿疣组织及邻近组织中P16和Ki-67的表达.中国麻风皮肤病杂志,2009,25(8):573-575.
3李遇梅,李安生,姚煦,等.系统性红斑狼疮患者DNA p16基因启动子区的甲基化状态.中华皮肤科杂志,2005,38(7): 419-422.
4崔盘根,季江.系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞及中性粒细胞p16基因甲基化状态研究.临床皮肤科杂志,2005,34(12):804-806.
5夏永华,李红文,丁一.银屑病角质形成细胞p16启动子甲基化的研究.中华皮肤科杂志,2006,39(3):128-130.
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9 Hardie LJ,Darnton SJ,Wallis YL,et al.p16 expression in Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma:association with genetic and epigenetic alterations.Cancer Letters,2005,217 (2):221-230.
10 Nemes JA,Deli L,Nemes Z,et al.Expression of p16,p53,and Rb proteins are independent from the presence of human papillomavirus genes in oral squamous cell carcinoma.Oral Surg Dral Med Oral Pothol Oral Radiol Endocl,2006,102:344-352.
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(收稿:2013-04-23 修回:2013-05-28)
The hypermethylation of p16 gene promoter region and the expression of p16 mRNA in condyloma accuminatum
XU Hui,MA Hong,MIN Min,et al.The Affiliated Hospital of Jiang Su University,Zhenjiang,212000
Objective:To determine the relationship between the hypermethylation of the p16 gene promoter region and the expression of p16 mRNA in condyloma accuminatum(CA)tissue.Methods:The hypermethylation of p16 gene promoter CpG island and the expression of p16 mRNA were detected by methylationspecific PCR and RT-PCR respectively in CA tissue from 30 patients and 20 healthy controls.Results:The rates of the hypermethylation of p16 gene promoter in CA tissue and normal skin were 26.67%(8/30)and 0,with a significant difference(P<0.05).The expression of p16 mRNA in hypermethylation CA tissue was higher than that in unmethylated CA tissue and normal tissue.Conclusion:The hypermethylation of p16 gene promoter region does not lead to the loss of p16 mRNA expression in CA tissue.
condyloma accuminatum;HPV;methylation;p16 gene
镇江市科技局基金资助项目(编号:SH2008040)
江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江,212000
∗通信作者