局灶性脑缺血再灌注大鼠神经血管单元的空间构筑①

金媛媛，胡静，冯璐，李杨，陈烨鋆，胡晓松，李帅

局灶性脑缺血再灌注大鼠神经血管单元的空间构筑①

金媛媛1a，胡静1a，冯璐1a，李杨1a，陈烨鋆1a，胡晓松1b，李帅1b

目的研究局灶性脑缺血不同再灌注时间段大鼠脑血管、神经元和星形胶质细胞的空间构筑。方法24只Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=8)和模型组(n=16)，模型组再平均分为再灌注1 d和2周两个亚组。线栓法大鼠大脑中动脉闭塞1 h后再灌注。各组活体灌注明胶墨汁。按时间取脑组织冰冻连续切片，免疫组织化学法观察胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元核心抗原(NeuN)的表达。结果血管在皮质或神经核等处分布较多，多数星形胶质细胞突起与血管及神经元接触。模型组缺血侧GFAP表达较假手术组持续增多，NeuN表达减少。再灌注1 d缺血侧血管数目明显减少，再灌注2周后增多，但仍低于假手术组及非缺血侧。结论观察到脑缺血再灌注大鼠神经血管单元的构筑。

局灶性脑缺血；再灌注；神经血管单元；空间构筑；大鼠

[本文著录格式]金媛媛，胡静，冯璐，等.局灶性脑缺血再灌注大鼠神经血管单元的空间构筑[J].中国康复理论与实践, 2015,21(1):31-34.

CITED AS:Jin YY,Hu J,Feng L,et al.Spatial organization of neurovascular unit after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats[J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):31-34.

由神经元及其相关的胶质细胞、内皮细胞等组成的功能单元，被称之为“神经血管单元”(neurovascular unit,NVU)。NVU是美国国立神经病学与卒中研究所(National Institute of Neurological Disorders and Stroke,NINDS)2002年提出的脑卒中治疗的概念模型[1]，这个概念将血管、神经元及神经胶质细胞的相互作用看作一个整体进行研究。脑缺血后，随着多种炎症介质的释放，发生血脑屏障受损、通透性增大，神经元变性坏死、胶质细胞增生等一系列复杂的病理变化。为了解作为结构功能一体化的NVU空间构筑改变，本研究采用线栓法制作大脑中动脉闭阻(MCAO)模型[2]，通过明胶墨汁灌注、免疫组化等方法观察脑血管、星形胶质细胞和神经元时空变化情况。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

清洁级Sprague-Dawley大鼠24只，体质量(250± 40)g，雌雄不拘，由四川达硕生物有限公司提供。兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)、小鼠抗大鼠神经元核心抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)：美国ABCAM公司。Polymer双染检

测试剂盒、兔二抗PV6001、鼠二抗PV6002：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验动物分组

实验动物编号后，用Excel随机数发生器产生随机数字，将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注1 d和2周模型组，每组8只。

1.3 模型制备

大鼠术前禁食12 h，称重。3.6%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉。仰卧位固定于手术台上。取颈正中切口，逐层切开暴露左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，在近心端结扎颈总动脉和颈外动脉，于颈总动脉结扎的远心端剪一小口，刺入浸于2.5×106U/L肝素钠的长5 cm、直径0.26 mm、头端圆钝的尼龙线，经颈总动脉分叉部进入颈内动脉约(19.0±0.5) mm，轻微遇阻即止。固定尼龙线并全层缝合切口。1 h后抽出尼龙线实现再灌注。假手术组插入尼龙线长度10 mm，其他步骤同模型组。

1.4 神经功能缺损评分

麻醉清醒后，采用Longa法[5]对动物进行神经功能缺损评分，判断模型是否成功。评分标准：0分，无神经功能缺失症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，爬行时出现对侧转圈；3分，行走时向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。将评分为1～2分的大鼠纳入模型组。

1.5 墨汁灌注与取材

动物按预定再灌注时间腹腔注射过量3.6%水合氯醛。仰卧位固定，剪开腹壁，暴露并剪开膈肌，剪开胸腔，暴露心脏。用眼科剪在心尖处剪一切口，将灌注针插入左心室，并于右心耳处剪一小口。向主动脉方向灌入37℃生理盐水，直至右心耳流出清亮的液体。经左心室在大鼠平均动脉压下灌注37℃含3%明胶的墨汁20 ml；再在180%大鼠平均动脉压下灌注含5%明胶的37℃墨汁30 ml。结扎主动脉，将大鼠立即放于4℃冰箱中2 h，以利于明胶凝固，防止墨汁流失。用组织剪将大鼠颈部剪开，咬骨钳咬开颅骨，完整取出大脑，立即置于-80℃冰箱中保存待检。

脑组织从冰箱中取出，置10%中性甲醛液固定24 h，再浸入30%蔗糖溶液中，常温下至标本沉底(防止冰晶形成)。-15℃恒冷连续冰冻切片，片厚5 μm，每隔5张取1张，吹干后置-80℃冰箱中保存。

1.6 免疫组化双标记法

采用Envision二步法进行。切片加入梯度乙醇浸水，0.01 mol/L PBS液(pH=7.2)洗3次，每次3 min，高压修复4 min；PBS洗3次。加入3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，PBS洗3次；羊血清封闭，滴加GFAP(1∶500)和NeuN(1∶200)一抗4℃冰箱过夜；复温，PBS洗3次，滴加二抗，37℃恒温箱中40 min，PBS洗3次。DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，封片。

1.7 免疫双染检测法

一抗GFAP、NeuN分别按1∶250和1∶100稀释，严格按双染试剂盒说明书进行冰冻切片染色。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 血管

再灌注1 d，模型组缺血侧纹状体区血管数较假手术组及非缺血侧明显减少(P＜0.01)，并且观察到部分血管通透性增高；再灌注2周，缺血侧纹状体区血管数较假手术组及非缺血侧减少(P＜0.05)，但较再灌注1 d时增加(P＜0.05)。见表1。

表1 各组纹状体区血管数比较(n)

2.2 免疫组化

假手术组观察到NeuN在神经元胞核和胞浆中表达。再灌注1 d，缺血侧NeuN阳性细胞数较假手术组及非缺血侧明显减少(P＜0.01)；再灌注2周，缺血侧NeuN阳性细胞数较假手术组及非缺血侧明显减少(P＜0.01)。见表2。2周时，部分缺血中心区可见少量存活NeuN阳性细胞，呈条索状分布，其内常见血管存在(图1)。

表2 各组NeuN阳性细胞数比较(n)

假手术组GFAP阳性表达胞体小，突起细，数量少(图1)。再灌注1 d，缺血侧胼胝体区GFAP阳性细胞数目较假手术组及非缺血侧增加(P＜0.05)；再灌注2周，缺血侧GFAP阳性细胞数较假手术组及非缺血侧明显增加(P＜0.01)。见表3。

血管主要分布在皮质或神经核等处，神经元分布密集的区域血管分布也相对密集。星形胶质细胞主要分布在血管的周围。星形胶质细胞通过细胞突起与神经元发生联系，同时星形胶质细胞突起末端终足包裹着血管，充当神经元与血管之间的纽带与桥梁作用(图1)。

表3 各组胼胝体GFAP阳性细胞数比较(n)

图1 血管、NeuN、GFAP分布

3 讨论

NVU的概念强调神经元、胶质细胞、血管在结构和功能上的整体性，并且重视不同细胞成分间的相互作用和相互联系。有研究表明，NVU中，星形胶质细胞参与包裹血管壁99%以上面积，并与内皮细胞相互影响和作用，具有增加紧密连接，减少缝隙连接的作用[3]。星形胶质细胞也通过突起与神经元发生联系。因此，星形胶质细胞在神经元与血管之间发挥重要的纽带与桥梁作用，介导NVU各组分间的相互作用[4]。

本研究观察到，脑缺血后，多数激活的星形胶质细胞通过突起与血管及神经元接触，缺血区NeuN阳性细胞减少，并随再灌注时间延长进一步减少；同时缺血区血管数减少，并可见明胶墨汁外渗到血管外的血管壁受损情况。此外，在假手术组及非缺血侧脑组织，血管数在皮质区最多，CPU区较少，提示血管分布与神经元密度及其相应的功能一致[5]。

脑血管在神经网络中扮演重要角色。许多生理和行为会影响神经系统血管的形态结构。应用明胶墨汁灌注法研究血管的形态结构的变化取得了较好的效果[6-7]。明胶属动物蛋白，易溶于温水，冷却后形成凝胶，其溶解度与凝固温度相差很小。明胶墨汁的浓度较高，导致微血管灌注不充分；3%和5%明胶墨汁配合使用，可使血管的各级分支灌注更充分[8-12]。

本研究观察到，假手术组灌注后，脑组织表面黑色分布均匀，而模型组缺血侧明胶墨汁灌注黑色分布较非缺血侧少，与文献报道一致[13]。从灌注的脑组织

的表面观察，提示应用明胶墨汁进行灌注时，明胶墨汁的浓度、温度、灌注量以及灌注时压力大小对于灌注结果都有影响。

NVU概念的提出是基于改善脉管系统及其他微环境成分，以减轻脑卒中、脑损伤和神经退行性变而导致的包括神经元、神经胶质细胞和血管细胞在内的神经细胞死亡的症状。急性缺血性脑卒中可快速触发NVU损伤，导致血脑屏障等发生变化，通过血脑屏障损伤机制导致脑水肿、炎性细胞浸润等继发性脑损伤[14]。本研究应用明胶墨汁显示血管、用GFAP/NeuN免疫组化双标记法在同一个组织切片中同时标记星形胶质细胞和神经元，较好显示NVU的空间构筑关系；观察到星形胶质细胞突起末端终足包裹血管，星形胶质细胞通过细胞突起与神经元发生联系，提示星形胶质细胞在神经元与血管之间起着纽带与桥梁作用[15]。与其他应用类似的研究[7-8,10]相比，本研究行免疫双标染色，更好地显示血管、神经元和星形胶质细胞三者之间的空间关系。

本研究尚有不足之处。为了清晰观察细胞形态，切片较薄，行免疫组织化学复染后，部分纤细的血管墨汁显色较淡。可尝试适当增加切片厚度或改善墨汁明胶的比例，在不影响细胞形态观察的基础上更好地显示微细血管。

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Spatial Organization of Neurovascular Unit after Focal Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

JIN Yuan-yuan,HU Jing,FENG Lu, LI Yang,CHEN Ye-yun,HU Xiao-song,LI Shuai.Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China

Objective To investigate the spatial organization of neurons,blood vessel and astrocytes at different time of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats.Methods 24 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=8),reperfusion 1 day group and reperfusion 2 weeks group.The latter 2 groups were occluded the middle cerebral arteries for an hour and reperfused.All the rats were injected with gelatin ink.The expressions of glial fibrillary acid protein(GFAP)and neuronal nuclear antigen(NeuN)in the brain were observed with immunohistochemistry.Results The vessels located mainly in cortex and nucleus.Most of astrocytes apophysis connected with vessels and neurons.Compared to the sham group,the expression of GFAP increased significantly in ischemic side,and the expression of NeuN decreased 1 day and 2 weeks after ischemia-reperfusion.The vessels decreased in the ischemic side 1 day after cerebral ischemia-reperfusion,and then increased 2 weeks later.Conclusion The organization of neurovascular unit after cerebral ischemia-reperfusion has been observed.

focal cerebral ischemia;reperfusion;neurovascular unit;spatial organization;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.008

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0031-04

2014-08-18

2014-09-19)

成都医学院大学生创新性实验项目基金资助(No.CXXS201304)。

1.成都医学院，a.临床医学系；b.形态学实验室，四川成都市610500。作者简介：金媛媛(1991-)，女，河南商丘市人，本科生。通讯作者：胡晓松(1972-)，男，四川广安市人，硕士，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：脑缺血损伤及修复研究。E-mail:woodwind@sohu. com。