神经节苷脂诱导U251细胞内质网应激相关凋亡

王雪晶，丁雪冰，滕军放，马明明，王志红

(1.郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州450052;2.河南省人民医院神经内科，河南 郑州450003;3.郑州大学第二附属医院妇产科，河南 郑州450014)

神经节苷脂(monosialotetrahexosy-1 ganglioside， GM1)是细胞膜的主要成分［1］。以往研究［2］发现外源性GM1 与脂蛋白结合，可通过血脑屏障进入中枢神经系统，参与神经修复及重构的病理生理过程。胶质瘤是常见的颅内原发肿瘤，至今为止没有有效的治疗手段。本课题组之前研究已证实GM1 通过上调巨自噬水平诱导了胶质瘤细胞的自噬性死亡，本研究进一步探讨GM1 通过调控恶性脑胶质瘤细胞U251 内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)诱导其凋亡的具体机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人脑星形胶质瘤细胞系U251 购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，常规培养于含体积分数12%胎牛血清的DMEM 完全培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，每1 ～2 d 换液1 次。待细胞铺满培养瓶底90%后，以消化液(含质量分数0.3%胰蛋白酶和质量分数0.05%EDTA)消化，1∶4 比例传代。

1.2 MTT 法检测细胞存活率 U251 细胞接种于96孔板(密度为3 × 103/孔)，次日对照组给予常规DMEM 培养基，实验组分为3 个浓度组，分别加入0、100、250 μg·mL－1的GM1，每组设4 个复孔，培养48 h，弃培养基，每孔加10 μL MTT 和90 μL 无血清DMEM 培养基，37 ℃孵育2 h，加入150 μL DMSO 振荡溶解，酶标仪于570 nm 波长处测量吸光度(A)值，细胞存活率(%)=实验组A 值/对照组A 值×100%。

1. 3 LDH 释放检测 实验组加入0、100、250 μg·mL－1的GM1，培养48 h 后，收集细胞培养基，按照LDH 试剂盒说明操作并计算LDH 释放率。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 实验组加入0、100、250 μg·mL－1的GM1，48 h 后收集细胞，预冷1 ×PBS洗涤后弃去上清，重悬细胞于Annexin 结合缓冲液，每份标本容量为120 μL，加入8 μL Alexa Fluor 488 AnnexinⅤ和2 μL 100 μg·mL－1PI 工作液，室温下孵育15 min，加入400 μL Annexin 结合缓冲液，在冰上轻轻混匀，立即用流式细胞仪检测分析。

1.5 Western blot 法检测蛋白表达 0、100、250 μg·mL－1的GM1 孵育48 h 后收集细胞，提取总蛋白并检测。经SDS-PAGE 电泳，湿转至PVDF 膜后封闭，加入抗CHOP(1 ∶500)、抗caspase-12(1 ∶500)抗体，4 ℃过夜。加入HRP 标记的二抗，孵育2 h，ECL 液显色，胶片曝光，GAPDH 设为内参。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0 进行分析，计量资料用±s 表示，组间比较采用t 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 GM1 对U251 细胞存活率的影响 MTT 法检测结果显示:0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，U251 细胞存活率分别为(96. 0 ±4. 2)%、(74. 1 ±13.2)%、(59.2 ±10.3)%，与对照组比较差异有统计学意义(P 均＜0.05)，且呈剂量依赖性。见图1。

图1 GM1 对U251 细胞存活率的影响

2.2 GM1 对U251 细胞LDH 释放率的影响 U251细胞经0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，收集培养上清液，按照LDH 试剂盒说明操作并计算LDH释放率。LDH 释放率(%)= 上清LDH/总LDH ×100%，以对照组为100%，实验组与对照组比较。0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，U251 细胞LDH释放 率 为(100. 0 ± 6. 3)%、(140. 0 ± 15. 5)%、(172.0 ±11.3)%，与对照组比较差异有统计学意义(P 均＜0.05)，且呈剂量依赖性。见图2。

图2 GM1 对U251 细胞LDH 释放率的影响

2.3 GM1 对U251 细胞凋亡率的影响 0、100、250μg·mL－1GM1 作用48 h 后，U251 细胞凋亡率为(3.1±0.2)%、(16.0 ±1.9)%、(37.1 ±12.1)%，与对照组比较差异有统计学意义(P 均＜0.05)，且呈剂量依赖性。见图3。

图3 GM1 对U251 细胞凋亡率的影响

2.4 GM1 对U251 细胞CHOP、caspase-12 表达水平变化的影响 与对照组比较，0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，CHOP 表达水平明显上调，且呈现剂量依赖性(P ＜0.05);caspase-12 活性片段表达水平明显上调，且呈现剂量依赖性(P ＜0.05)。见图4。

图4 GM1 对CHOP 及caspase-12 表达水平的影响

3 讨论

内质网是真核细胞的蛋白质翻译后修饰、折叠和组装的场所，当蛋白质相关修饰以及蛋白质由内质网向高尔基体转运等过程受阻，或错误折叠的蛋白质在内质网大量蓄积则会损伤内质网的正常生理功能，称为ERS［3］。ERS 主要激活3 条信号通路:未折叠蛋白反应、内质网相关蛋白降解功能和调节多肽进入内质网的蛋白质的翻译过程的调控［3］。ERS 介导的细胞凋亡是一种新的凋亡途径，与死亡受体途径和线粒体途径不同，ERS 诱导细胞凋亡过程更为复杂，主要通过3 种途径:CHOP 途径、ASK1-JND 途径和caspase-12途径［4］。ERS 是一种高度保守的细胞反应机制，适度的ERS 对细胞有保护作用，而过度的ERS 启动了ERS相关凋亡过程。研究［5］表明，ERS 与肿瘤的发生、发展密切相关，而ERS 介导的肿瘤细胞凋亡是肿瘤细胞自然死亡的一种重要形式，这为肿瘤治疗研究提供新方向。

根据糖基数目不同，GM 分为GM1(含4 个糖基)、GM2(含3 个糖基)和GM3(含2 个糖基)［6－7］。随着研究的不断深入，人们逐渐发现GM1 不紧参与调节胚胎发育、神经生长与修复等生理过程，也参与抑制了肿瘤的发生、发展及转移等病理过程，但具体机制仍不明［8］。胶质瘤是原发于神经系统最常见的肿瘤之一，恶性胶质瘤预后差，平均生存周期不超过1 a［9］。手术是胶质瘤的主要治疗方式，但术后易复发，各种单一的治疗方案难以取得令人满意的效果。因此，探索新的治疗手段具有重要意义。本研究发现，随着GM1 浓度的增加U251 细胞存活率明显降低，细胞损伤增加，细胞凋亡率增加，呈现剂量依赖性。进一步研究证实，随着GM1 浓度的增加可诱导U251 细胞ERS 相关通路CHOP/caspase-12 激活，从而诱发ERS 相关凋亡的启动，导致U251 细胞的死亡。综上所述，GM1 通过诱导ERS 相关凋亡抑制了U251 细胞的生长，促进人脑星形胶质瘤细胞凋亡过程，为GM1 治疗恶性脑胶质瘤提供了新的理论依据。

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