RP-HPLC法同时测定香丹注射液中5-羟甲基糠醛和酚酸类成分的含量*

程巧鸳，郭增喜，陈碧莲

(浙江省食品药品检验研究院，杭州 310004)

RP-HPLC法同时测定香丹注射液中5-羟甲基糠醛和酚酸类成分的含量*

程巧鸳，郭增喜，陈碧莲

(浙江省食品药品检验研究院，杭州 310004)

目的 建立同时测定香丹注射液中5-羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法。方法 采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为乙腈-0.05%三氟乙酸溶液，梯度洗脱；检测波长288 nm，柱温30 ℃，流速0.8 mL·min-1。外标法计算含量。结果 5-羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的进样量与峰面积分别在0.002 73～1.364 00 μg(r=1.000 0)、0.274 80～13.740 00 μg(r=0.999 9)、0.034 64～1.732 00 μg(r=1.000 0)、0.053 59～2.680 00 μg(r=1.000 0)及0.105 30～5.264 00 μg(r=1.000 0)呈良好的线性关系；平均加样回收率依次为100.93%，101.36%，100.54%，105.14%，102.31%；RSD依次为1.00%，0.87%，0.51%，0.39%，1.91%。结论 该方法简便快速，重复性好，适合于同时测定香丹注射液中5-羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和迷迭香酸的含量。

香丹注射液；5-羟甲基糠醛；丹参素钠；原儿茶醛；迷迭香酸；丹酚酸B；色谱法，高效液相，反相

香丹注射液为临床常用的中药制剂，由丹参水提取液和降香经水蒸气蒸馏后的饱和溶液制备而成，具有扩张血管、增进冠状动脉血流量等作用，临床上主要用于治疗心绞痛、心肌梗死等。现行质量标准收载于《卫生部药品标准》第17册，“含量测定”项下仅控制原儿茶醛的含量[1]。研究表明，丹参的水溶性酚酸类$成分如丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B等均具有抗心肌缺血和缺氧的作用[2]。5-羟甲基糠醛是葡萄糖或果糖在高温或酸性等条件下脱水产生的一个醛类化合物，普遍存在于中药复方中，可导致横纹肌损害和内脏损伤等不良反应[3-4]。笔者从中药注射剂的有效性和安全性角度出发，建立同时测定香丹注射液中5- 羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，以更好地控制制剂质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配备紫外检测器。

1.2 试药 5-羟甲基糠醛对照品(批号：111626-200804，纯度>98%)，丹参素钠对照品(批号：110855-200809，供含量测定用)、原儿茶醛对照品(批号：110810-200506，供含量测定用)、丹酚酸B对照品(批号：111562-200807，供含量测定用)、迷迭香酸对照品(批号：111871-201001，含量98.8%)均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余为分析纯。香丹注射液样品来源于全国11家生产企业，共20批。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取5- 羟甲基糠醛、丹参素钠对照品、原儿茶醛对照品、迷迭香酸对照品和丹酚酸B对照品适量，精密称定，加0.2%醋酸的10%甲醇溶液制成每毫升含5- 羟甲基糠醛 2 μg、丹参素钠0.20 mg、原儿茶醛50 μg、迷迭香酸50 μg和丹酚酸B 100 μg的混合溶液，即得。

2.2 供试品溶液及缺丹参阴性对照溶液的制备 精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，加0.2%醋酸的10%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。另取降香药材，制备缺丹参阴性样品溶液，精密量取上述溶液2 mL，同供试品溶液制备法制备缺丹参阴性对照溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.05%三氟乙酸水溶液(B)为流动相，线性梯度洗脱(0～65 min，2%→30%A，98%→0%B；～66 min，30%→2%A，70%→98%B)；检测波长288 nm；柱温40 ℃；流速0.8 mL·min-1；进样体积5 μL。色谱图见图1。

2.4 线性关系的考察 分别精密吸取混合对照品溶液(每毫升含5-羟甲基糠醛2.728 μg、丹参素钠0.274 8 mg、原儿茶醛34.64 μg、迷迭香酸53.59 μg、丹酚酸B 105.3 μg)1，2，5，10，20，30，50 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线，并以最小二乘法计算得回归方程，见表1。

2.5 精密度实验

2.5.1 仪器精密度 精密吸取同一供试品溶液，连续进样6 次，所得5- 羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B峰面积的RSD依次为1.25%，0.07%，0.05%，0.11%和0.34%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性实验 精密吸取同一批样品(批号110908s-1)各6 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样5 μL，测定峰面积，计算得5- 羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的RSD分别为0.58%，0.46%，0.45%，0.44%和0.36%。

A.缺丹参阴性对照溶液；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液；1.5- 羟甲基糠醛；2.丹参素钠；3.原儿茶醛；4.迷迭香酸；5.丹酚酸B

图1 3种溶液的HPLC图

A.negative control solution withoutSalviamiltiorrhiza；B.mixed reference solution；C.test solution；1.5- hydroxymethyl furfural；2.sodiumdanshensu；3.protocatechuic aldehyde；4.rosmarinic acid；5.salvianolic acid B

Fig.1 HPLC chromatogram of three kinds of solutions

表1 5种对照品的回归方程、相关系数及线性范围

Tab.1 Regression equations，correlation coefficient and linear range of five kinds of reference substance

2.6 稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，18和24 h进样5 μL，测定峰面积，计算得5- 羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的RSD分别为1.76%，0.13%，0.46%，0.15%和0.49%。

2.7 准确度 采用加样回收率实验法，精密量取已知含量样品(批号110908s-1)1 mL，共6份，精密加入对照品适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，计算回收率，见表2。

表2 5种对照品加样回收率测定结果

2.8 样品测定 取不同企业生产的样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，外标两点法计算含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 检测波长选择 实验中分别设置了230，254，270，288，320 nm波长进行测定，结果5-羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B在288 nm波长处的紫外吸收较强，且基线平稳，因此选择288 nm作为检测波长[5]。

3.2 流动相选择 实验中比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-醋酸、乙腈-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸体系，最后确定乙腈-0.03%磷酸体系对注射液中5-羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B分离效果较好。但国家药典委员会要求将丹参系列品种的流动相进行统一，故对色谱系统进行调整，由乙腈-0.03%磷酸溶液改为乙腈-0.05%三氟乙酸溶液[6]。

3.3 耐用性考察 实验中比较了不同酸度、不同流速、不同柱温、不同仪器及不同色谱柱，包括不同品牌及同品牌不同批号色谱柱。结果发现，在一定范围内，所得色谱图基线平稳，分离效果较好，表明所建立的色谱条件耐用性较好。

本实验采用HPLC法同时测定了香丹注射液中5种成分的含量，结果显示该方法灵敏度高，重复性好，样品处理方法简单，可作为香丹注射液质量控制的方法。从测定结果看，不同企业生产的样品中5-羟甲基糠醛的含量差异显著。由于不同企业采用的原药材及规格均为每支10 mL生产工艺均有所不同，且5-羟甲基糠醛会随着加热时间、酸度、温度、储藏而发生变化，因此亟需对其制定合理的限度以降低安全风险[7]。此外，不同企业生产的样品其有效成分丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的含量差异也较显著，因此亟待提高现行质量标准以更好地控制产品质量。

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[3] ULBRICHT R J，NORTHUP S J，THOMAS J A.A review of 5-hydroxymethylfurfural(HMF) in parenteral solutions[J].Fundam Appl Toxicol，1984，4(5)：843-853.

[4] 闫琰，鄢丹，张萍，等.中药注射剂不良反应早期预警方法的研究(I)——安全相关物质5-羟甲基糠醛的研究[J].中华中医药杂志，2010，25(12)：2268-2270.

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.025

Simultaneous Determination of 5-Hydroxymethylfurfural and Phenolic Acids inXiangdanInjection by RP-HPLC

CHENG Qiaoyuan,GUO Zengxi, CHEN Bilian

(ZhejiangInstituteforFoodandDrugControl,Hangzhou310004,China)

Objective To establish a method for content determination of 5-hydroxymethylfurfural, sodiumdanshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinci acid and salvianolic acid B inxiangdaninjection by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) . Methods The analysis was performed on a Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column with acetonitrile-0.05% water solution of trifluoroacetic acid as mobile phase at the gradient elution mode with the flow rate of 0.8 mL·min-1.The column temperature was kept at 30 ℃ and the detector wavelength was set at 288 nm.The content was calculated with external standard method. Results The linear relationships between the concentration and peak area of 5-hydroxymethylfurfural, sodiumdanshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinci acid and salvianolic acid B were 0.002 73-1.364 00 μg(r=1), 0.274 80-13.740 00 μg(r=0.999 9),0.034 64-1.732 00 μg(r=1.000 0), 0.053 59-2.680 00 μg(r=1.000 0), and 0.105 30-5.264 00 μg(r=1.000 0), respectively.The average recovery and the RSD of the five components were 100.93%(1.00%)，101.36%(0.87%)，100.54%(0.51%)，105.14%(0.39%)，and 102.31%(1.91%), respectively. Conclusion This method has been proven to be simple, fast, reliable and reproducibile, which can be applied to the content determination of the five components inxiangdaninjection.

Xiangdaninjection; 5-Hydroxymethylfurfural; Sodiumdanshensu;Protocatechuic aldehyde; Rosmarinci acid; Salvianolic acid B; Chromatography,high performance liquid,reversed phase

2014-01-03

2014-06-16

*浙江省自然科学基金资助项目(LQ12H28001)

程巧鸳(1981-)，女，浙江永康人，副主任药师，博士，主要从事中药质量及其安全性研究。电话：0571-86459425，E-mail：cqy_427@126.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)01-0095-04