丹参胶囊水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱分析*

张珺，程月发，张爱兵

(1.河北联合大学冀唐学院，唐山 063300；2.河北省唐山市药品检验所，唐山 063000)

丹参胶囊水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱分析*

张珺1，程月发1，张爱兵2

(1.河北联合大学冀唐学院，唐山 063300；2.河北省唐山市药品检验所，唐山 063000)

目的 建立丹参胶囊水溶性成分的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。方法 利用HPLC法分析丹参胶囊的水溶性成分，色谱柱为Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇-乙腈-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长286 nm，柱温30 ℃；流速1 mL·min-1。结果 确定两个厂家丹参胶囊水溶性成分HPLC指纹图谱中的共有峰分别为9和22个，建立了两个厂家丹参胶囊水溶性成分的标准指纹图谱。结论 建立的丹参胶囊水溶性成分的HPLC指纹图谱重复性和稳定性良好，可适用于丹参胶囊水溶性成分的质量控制。

丹参胶囊；成分，水溶性；色谱法，高效液相；指纹图谱

丹参胶囊为市售常用中成药，其药效成分主要可分为水溶性的酚酸类成分和脂溶性的二萜醌类成分。其中水溶性的成分主要有丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B等，具有抗心肌缺血、增加冠状动脉血流量和清除自由基等作用[1-3]。目前较多研究集中在建立丹参药材及其制剂水溶性成分的指纹图谱[4-5]，但对丹参胶囊水溶性成分的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱研究笔者尚未见报道。笔者通过建立丹参胶囊水溶性成分的HPLC指纹图谱，以期为丹参胶囊质量标准的研究提供更好的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1100型系列高效液相色谱仪(美国Agilent公司)包括G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱和G1315B检测器；Chem StationRev.A10.02色谱工作站；BP211D电子天平(德国Sartorius公司)；SB2200超声波清洗机(上海Branson公司，频率50HZ)。

1.2 试药 丹参胶囊(西双版纳雨林制药有限责任公司，简称雨林公司，批号：100526，100701，100910，120526，120527，120721，120722，120820，120821，121103，121104，121105)；海南赛立克药业有限公司(简称赛立克公司)的丹参胶囊(批号：090802，100101，100901，111204，120305，120904，120905，121201，130101，130304)均市售购得。原儿茶醛对照品(批号：813-9201)购自中国食品药品检定研究院；丹参素(批号：22681-72-7)、迷迭香酸(批号：20283-92-5)、丹酚酸 B(批号：115939-25-8)和丹酚酸A(批号：96574-01-5)对照品均购自贵州迪大生物有限公司，纯度>98%；甲醇和乙腈均为色谱纯；磷酸为分析纯；水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为甲醇，B为乙腈，C为0.02%磷酸溶液；梯度洗脱，流动相比例见表1；柱温：30 ℃；流速1 mL·min-1；检测波长286 nm，进样量10 μL。

表1 梯度洗脱中流动相的比例

2.2 混合对照品、样品及阴性对照液的制备

2.2.1 混合对照品的制备 分别精密称取丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A 1.18，0.88，0.61，5.67 和0.42 mg置5 mL棕色量瓶中，加去离子水溶解并定容，配成浓度分别为236，176，122，1 134和84 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 样品溶液的制备 取丹参胶囊20粒，精密称定，研磨成粉末，精密称取0.30 g置于具塞锥形瓶中，精密加入去离子水20 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷，再称定总量，用去离子水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，溶液过孔径0.45 μm滤膜，即得。

2.2.3 阴性对照液的制备 分别按丹参胶囊的生产工艺制备缺丹参的阴性制剂，并按照样品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性实验 取赛立克公司批号为130101的丹参胶囊，按“2.2.2”项方法制得样品溶液，置于避光密闭容器。按本实验色谱条件，分别于0，2，4，8，12和24 h进行测定并记录色谱图，计算相对保留时间和相对峰面积。结果相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%。说明样品溶液在避光密闭容器中24 h内含量变化不大，比较稳定。

2.3.2 精密度实验 取赛立克公司批号为130101的丹参胶囊，按本实验色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果RSD均<2%。符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的相关规定。

2.3.3 重复性实验 取赛立克公司批号为130101的丹参胶囊，按“2.2.2”项方法分别平行制备6份样品溶液，按实验色谱条件记录丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的相对保留时间和相对峰面积。结果相对保留时间和相对峰面积RSD均<3%。符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的相关规定。表明本方法重复性良好，精密度较高。

2.4 指纹图谱的建立及分析

2.4.1 丹参胶囊水溶性成分HPLC指纹图谱的建立 对两个厂家共22批次丹参胶囊样品进行了测定，其中雨林公司的丹参胶囊HPLC图谱中共有42个峰，其指纹图谱中共有9个共有峰，见图1A，其中2号、5号和7号峰分别为丹参素、迷迭香酸和丹酚酸B(与对照品对照确认，见图1C)，但在共有峰中并未出现原儿茶醛和丹酚酸A的色谱峰。赛立克公司的丹参胶囊指纹图谱中共有89个峰，其指纹图谱中共有22个共有峰，4号、5号、16号和18号分别为丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B(与对照品对照确认，见图1C)，见图1B，但在共有峰中并未出现丹酚酸A的色谱峰。混合对照品图谱见图1C。两个厂家的HPLC指纹图谱见图2。阴性对照品HPLC图见图3。

A.丹参胶囊样品(雨林公司)；B.丹参胶囊样品(赛立克公司)；C.混合对照品色谱图；1.丹参素；2.原儿茶醛；3.迷迭香酸；4.丹酚酸B；5.丹酚酸A

图1 丹参胶囊样品及混合对照品色谱图

A.danshencapsule(yulincompany)；B.danshencapsule(sailikecompany)；C.mixture of standards；1.danshendu；2.protocatechuic aldehyde；3.rosmarinc acid；4.salvianolic B；5.salvianolic A

Fig.1 Chromatogram ofdanshencapsule and mixture of reference substance

分别选择图1B中的4号峰[4(s)]和1A中的2号峰[2(s)]作为各自指纹图谱中的参照峰，经与对照品对比，该峰为丹参素的色谱峰，由于丹参素在丹参胶囊中含量稳定，在色谱图中分离度较好且易辨认，因此选择丹参素作为丹参胶囊水溶性成分指纹图谱的参照物。见表2～5。

图3 阴性对照品HPLC图谱

Fig.3 HPLC chromatogram of negative reference

由以上结果可知，相对保留时间的RSD为0.061%～0.348%，相对峰面积RSD为12.365%～55.180%。由此可见，丹参胶囊水溶性分的种类一致性较好，但是有些成分在含量上有差别。

2.4.2 丹参胶囊水溶性成分HPLC指纹图谱相似度分析 指纹图谱相似度分析利用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004年A版)对测定结果进行计算，得到丹参胶囊水溶性成分的共有指纹图谱，对照共有指纹图谱，各样品相似度结果见表6，7。

由表6，7可以看出，除了雨林公司的3号丹参胶囊样品相似度接近0.9外，其他样品及共有模式的相似度均>0.99，相似度较好。因此，分别建立的两个厂家的丹参胶囊水溶性成分HPLC对照指纹图谱可行，可以作为评价丹参胶囊水溶性成分的标准指纹图谱。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择 本实验分别采用了乙腈-磷酸溶液、甲醇-磷酸溶液及甲醇-乙腈-磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱[6-7]。结果表明，采用甲醇-乙腈-0.02%磷酸溶液系统作为流动相对样品进行分离能达到良好效果。

采用二极管阵列检测器考察了270，280和286 nm波长下的样品色谱分离情况。从色谱中观察，在286 nm下色谱峰较多，因此选定286 nm作为检测波长。

R：对照指纹图谱

R：reference fingerprint chromatograms

R：对照指纹图谱

R：reference fingerprint chromatograms

3.2 指纹图谱建立及样品分析 本实验分别建立两个厂家丹参胶囊水溶性成分的HPLC对照指纹图谱，实验数据表明，指纹图谱的相似度较高。在对样品的相对保留时间和相对峰面积分析时发现，虽然样品在种类上一致性较好，但是一些成分在某些样品中未检测到，例如原儿茶醛和丹酚酸A，并且批次间成分的相对含量也存在一定差异。这可能是由不同批次的原料药存在差异所引起的。说明单凭测定一种成分的含量评价样品质量存在较大局限性。另外，从图谱中可知，两个厂家的样品存在一定差异，因此分别建立了各自的指纹图谱。

[1] ZENG G，TANG T，WU H J，et al.Salvianolic acid B protects SH-SY5Y neuroblastoma cells from 1-methyl-4-phenylpy-ridinium-induced apoptosis[J].Biolog Pharm Bull，2010，33(8)：1337-1342.

[2] LI W，LI Z W，HAN J P，et al.Determination and pharm-acokinetics of danshensu in rat plasma after oral admini-stration ofdanshenextract using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Eur J Drug Metab Pharma，2008，33(1)：9-16.

[3] 余洪松，凌琳，谢峻，等.丹参注射液对小鼠体外心肌细胞的影响[J].医药导报，2013，32(2)：167-170.

[4] 雷敏，宋敏，王爽，等.丹参制剂中丹参水溶性成分的指纹对照法质量分析[J].中国药科大学学报，2008，39(3)：238-242.

[5] 程建明，葛婷婷，郑云枫.丹参滴注液酚酸类成分指纹图谱及其峰归属研究[J].时珍国医国药，2013，24(4)：979-982.

[6] 张珺，程月发，张爱兵，等.不同厂家的丹参片和丹参胶囊中四种活性成分的高效液相色谱法比较分析[J].时珍国医国药，2012，23(11)：2790-2791.

[7] 王国辉，王建茹，程月发，等.不同厂家丹参胶囊中 4 种主要活性成分含量比较[J].医药导报，2013，32(2)：233-235.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.024

HPLC Fingerprint Analysis of Water-soluble Components inDanshenCapsules

ZHANG Jun1,CHENG Yuefa1,ZHANG Aibing2

(1.CollegeofJitang,HebeiUnitedUniversity,Tangshan063300，China; 2.TangshanInstituteforDrugControl,HebeiProvince,Tangshan063000，China)

Objective To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint of water-soluble components indanshencapsules. Methods The HPLC was performed on a Thermo Syncronis C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm) with methanol-acetonitrile-phosphoric acid in water as mobile phase in gradient elution at a flow rate of 1 mL·min-1, and the column temperature was kept at 30 ℃.The detection wavelength was 286 nm. Results Nine and 22 common peaks were selected as the HPLC fingerprints of water-soluble components indanshencapsules from two manufactures, respectively.The standard HPLC fingerprints of water-soluble components were established. Conclusion The analysis is stable and reproducible, which can be applied to the quality control for water-soluble components indanshencapsules.

Danshencapsules; Water-soluble components; Chromatography, high performance liquid; Fingerprint

2013-11-20

2014-03-18

*2013年唐山市科学技术研究与发展计划基金资助项目(13130298z)；2012年河北联合大学科学研究基金资助项目(z201242)

张珺(1984-)，女，河北唐山人，讲师，硕士，主要从事药物分析工作。电话：0315-8114108，E-mail：zhangjun_2402@163.com。

程月发(1967-)，男，安徽桐城人，副教授，博士，主要从事天然产物药理学工作。电话：0315-8114108，E-mail：arthurcyf@163.com。

R282.71；R927

B

1004-0781(2015)01-0089-06