阿拉善双峰驼卵泡发育过程中颗粒细胞差异蛋白质组学研究

陶金忠，赵国顺，赵兴绪，胡俊杰，张 勇

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.天水市动物疫病预防控制中心，甘肃 天水 741600；3.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070）

阿拉善双峰驼卵泡发育过程中颗粒细胞差异蛋白质组学研究

陶金忠1，赵国顺2，赵兴绪3，胡俊杰3，张 勇3

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.天水市动物疫病预防控制中心，甘肃 天水 741600；3.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070）

为了比较阿拉善双峰骆驼卵泡发育过程中颗粒细胞内蛋白质表达的变化，根据卵泡直径将颗粒细胞分为两类，利用双向电泳技术构建阿拉善双峰骆驼颗粒细胞蛋白质二维凝胶电泳图谱，凝胶经考马斯亮蓝染色后，以3倍以上的表达变化用PDQuest 8.0软件比较这两类颗粒细胞中蛋白质的表达差异。结果共检测到了12个差异点，经MALDI TOF/TOF-MS/MS鉴定发现它们是12种不同的蛋白质。其中丙酮酸脱氢酶E1、annexin A2可能与颗粒细胞能量代谢有关，这为阿拉善双峰骆驼颗粒细胞的研究奠定了理论依据。

阿拉善双峰骆驼；二维电泳；蛋白质组学；颗粒细胞

阿拉善双峰驼是国家二级保护动物，其生殖特点与大多数哺乳动物不同的是它的排卵方式为诱导排卵[1]。颗粒细胞增殖分化是卵泡发育的重要环节，其是由原始卵泡中的卵泡细胞在卵泡发育的初级卵泡阶段形成的，颗粒细胞的分化过程也是卵泡的发育过程。颗粒细胞通过合成多种激素及生长因子，并表达其受体来调控卵母细胞的生长、排卵以及卵泡的启动、发育和闭锁[2]。如雌激素受体α、褪黑素等多种蛋白质通过颗粒细胞调节生殖生理机能。蛋白质组学可以让人们从蛋白质整体水平理解颗粒细胞，目前并没有关于颗粒细胞蛋白质组学的报道。因此，我们根据卵泡的大小将颗粒细胞分为两类，用蛋白质组学技术寻找不同大小卵泡中颗粒细胞内蛋白表达的差异，从而为探索双峰驼卵泡发育过程中颗粒细胞生理机制的研究提供参考依据。

1 方法

1.1 样品采集与制备 于西宁屠宰场采集宰杀后阿拉善驼的卵巢，共24个，置于加有双抗的37℃生理盐水中带回实验室。将卵巢用灭菌的生理盐水

冲洗后，按照卵泡的直径将其分为两类（d≤10mm；d＞10mm），然后在无菌条件下用1mL注射器吸取卵泡液，均匀混合。将卵泡液10 000 r/min（4℃）离心5min弃去上清，用100μL的PBS冲洗后10 000 r/min（4℃）离心5min，弃上清，加入100μL的蛋白质裂解液，置于液氮罐中反复冷冻10次，常温溶解后，涡旋30 s。Bradford法定量。

1.2 双向电泳 具体步骤参照Bio-Rad蛋白质组学双向电泳实验操作手册。

将样品与上样缓冲液混合后，100 00 r/min（4℃）离心10 min。设置等电聚焦程序：50 V，14 h（主动水化）；250 V（线性），1 h；1 000 V（线性），1 h；9 000 V（线性），6 h；9 000 V（线性），80 000 Vh；500 V（快速），任意时间。第一项结束后分别用6mL的胶条平衡缓冲A液和6mL的胶条平衡缓冲B液平衡15 min。然后用12%SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白，设置电泳程序：50 V，1 h；然后调至200 V，待溴酚蓝线距离玻璃板下沿1 cm时停止电泳。

1.3 差异点质谱检测 经染色后脱色的凝胶用扫描议扫描。再用PDQuest8.0软件以蛋白表达谱上“斑点染色强度和面积三倍量的变化”为标准进行差异分析，检测差异蛋白点。然后切取差异蛋白点，在脱色和胰酶消化后，用MALDI-TOF/ TOF-MS分析，用Mascot软件搜索NCBInr蛋白质数据库，蛋白质的C.I.得分大于95%则认为此蛋白有意义。

2 结果

2.1 凝胶电泳图谱分析 用双向电泳技术建立了阿拉善双峰驼颗粒细胞蛋白质的2-DE图谱（图1）。以3倍以上的表达变化用PDQuest8.0软件从这两种卵泡的颗粒细胞中共检测到了12个差异蛋白点（如图1）。其中，点7，9，10，11，12只在大卵泡的颗粒细胞中表达，点1，6只在小卵泡的颗粒细胞中表达，其他的蛋白点在两类卵泡的颗粒细胞中都有表达。点2，3，4，5随着卵泡的增大而减少，点8随着卵泡的增大而增多。

图1 阿拉善驼不同大小卵泡颗粒细胞的蛋白质组学2-DE图谱A：卵泡直径小于等于10mm；B：卵泡直径大于10mm；1～12：是差异表达的蛋白质点的编号

2.2 质谱鉴定 用MALDITOF/TOF-MS/MS鉴定12个差异蛋白点，发现它们是12种蛋白质（如表1），点1是血红蛋白α，点2是线粒体型的ETHE1前体，点3是线粒体内的丙酮酸脱氢酶E1β亚基，点4是硫代硫酸硫基转移酶，点5是annexin A2，点6是细胞角蛋白8，点7是一种假想蛋白，点8是血红蛋白β，点9是蛋白激酶C，点10是COMM区域包含蛋白10样蛋白，点11是线粒体内膜蛋白独立岛1，点12是28S核糖体蛋白S18b。这些蛋白含量的变化在图2中详细说明。

3 讨论

3.1 丙酮酸脱氢酶E1β亚基 丙酮酸脱氢酶是线粒体内能量代谢的限速酶，催化生物体内丙酮酸转变成乙醘辅酶A，从而参与三大营养物的最终代谢。其主要包括三类：E1、E2和E3；E1是由E1α和E1β各两个单位组成的四聚体，已经发现丙酮酸脱氢酶E1β亚基在小鼠精子获能过程中发生酪氨酸磷酸化，对于精子获能过程中糖酵解的调节起到一定作用[3]。NandiS 1等[4]研究发现，随着卵泡直径的增加，葡萄糖浓度也随之增加，说明个体较大卵泡需要更多葡萄糖，葡萄糖的需求量增加除了从增加外界摄入外，可能还需要抑制某些机体内葡萄糖的分解过程。并且还发现在卵泡内存在特异的葡萄糖转运载体GLUT1和GLUT4[5]，说明葡萄糖确实作为能量物质参与卵泡发育。我们发现在大卵泡中的颗粒细胞内丙酮酸脱氢酶E1β亚基的含量少于小卵泡的颗粒细胞，这可能是随着第3期卵泡的不断增大，颗粒细胞的增殖不断放慢，需要的能量也不断减少的原因。

表1 MALDITOF/TOF-MS/MS鉴定的颗粒细胞中差异表达的蛋白质

图2 阿拉善驼不同大小卵泡颗粒细胞中差异表达的蛋白质的含量变化

3.2 annexin A2 annexin A2是annexin家族的成员之一，annexins有20多个成员，大多数都与生殖有关。annexin A2是一种纤溶酶受体，与细胞的增殖、凋亡有关，具有RNA结合的特性，还与DNA合成、复制有关[6]。有研究发现，annexin A2和其配体S100A10的基因在小鼠多种组织中都有表达，在卵巢和子宫等生殖器官中表达水平尤为高[7]。通过RNA干扰和抗体干扰的方法表明，Annexin A2参与依赖胰岛素的GLUT-4的跨膜转运，并影响葡糖糖的转化[8]。对双峰驼的研究发现，大卵泡的颗粒细胞中的annexin A2含量低于小卵泡。而小卵泡需要更多的葡糖糖来增值，所以，可以推测Annexin A2的增多主要是为了满足跨膜转运更多的葡糖糖。但是，目前发现，GLUT-4只在肌肉细胞和脂肪细胞中表达。因此，Annexin A2是否通过GLUT-4调节颗粒细胞内的能量代谢还有待研究。

4 结论

本文首次通过研究不同直径卵泡中颗粒细胞内的蛋白质组学，建立颗粒细胞二维电泳图谱，经蛋白质组学和生物信息学的分析，发现丙酮酸脱氢酶E1、annexin A2可能与颗粒细胞的能量代谢有关。

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Com parative proteom iesstudy of Alax Bactrian CamelG ranulosa Cells between the different periodsof follicular development

TAO Jin-zhong1，ZHAOGuo-shun2，ZHAO Xing-xu3，HU Jun-jie3，ZHANG Yong3
（1.Agricultural College，Ningxia University，Yinchuan 750021，China；2.Tianshuianimal Disease Prevention and Control Center，Tianshui741600，China；3.College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

The aim of this study was to identify differentially expressed proteins in the granulosa cells of Alax Bactrian Camel during follicular development.Granulosa cellswere divided into two groups according to their diameter.2-dimensional gel electro⁃phoresis（2-DE）was performed to analyze the granulosa cell samples.Differential proteinswere detected by PDQuest 8.0 software after stained with commassie blue.12 differentially expressed spots were observed.These spots were identified by MALDI TOF/ TOF-MS/MS.12 unique proteinswere be found.We hypothesize that pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta and an⁃nexin A2 play a role in the energy metabolism of granulosa cells.This study provides a solid basis for further study on granulosa cells of Alax Bactrian Camel.

two-humped Camel；proteomic analysis；follicular development；2-DE

ZHAO Xing-xu

Q 958.1

A

0529-6005（2015）11-0003-03

2015-03-24

国家自然科学基金项目（31001095）

陶金忠（1977-），男，副教授，博士，从事动物生殖生理、动物繁殖障碍、蛋白组学研究，E-mail：tao_jz@nxu.edu.cn

赵兴绪，E-mail：zhaoxx@gsau.edu.cn