葛根复方对实验性自身免疫性重症肌无力大鼠血清RNS和AchR-Ab表达影响

文颖娟， 杨俊超

（陕西中医药大学，陕西咸阳712046）

葛根复方对实验性自身免疫性重症肌无力大鼠血清RNS和AchR-Ab表达影响

文颖娟， 杨俊超

（陕西中医药大学，陕西咸阳712046）

目的 研究葛根复方 （葛根、黄芪、丹参、苍术、黄柏等）对实验性自身免疫性重症肌无力大鼠腓肠肌重复性神经刺激电位（RNS）和乙酰胆碱受体抗体 （AchR-Ab）表达的影响，并探讨其机制。方法 将100只Lewis大鼠随机分为4组，除正常组，模型组、强的松组、葛根复方组采用皮下注射鼠源性AchR-α亚基97～116肽段方法建立重症肌无力的实验模型，造模成功的两组分别给予强的松、葛根复方灌胃4周，观察大鼠治疗前后的RNS和AchR-Ab的变化。结果 治疗前与正常组比较，造模各组大鼠的RNS都有明显衰减；治疗后与模型组比较，强的松组和葛根复方组的RNS衰减程度都减弱；治疗后与强的松组比较，葛根复方组的RNS衰减程度明显低。治疗前造模各组大鼠的AchR-Ab表达水平明显高于正常组（P＜0.01）；强的松组和葛根复方组治疗后和模型组比较，两组中AchR-Ab表达水平明显下降 （P＜0.05）；治疗后强的松和葛根复方组比较，葛根复方组的AchR-Ab表达水平明显偏低 （P＜0.05）。结论 葛根复方能促进实验性自身免疫性重症肌无力大鼠腓肠肌的肌力恢复。

实验性自身免疫性重症肌无力；葛根复方；重复性电极刺激电位 （RNS）；乙酰胆碱受体抗体 （AchR-Ab）

One hundred Lewis rats were random ly and equally divided into four groups，except the control group，rats in other three groups，including themodel，Compound Gegen Decoction and Prednisone groups，were immunized with rat-derived 97-116 peptide of the AchRα-subunit.After the EAMGmodelwas successfullymade，the rats in two groupswere administered with Prednisone and Compound Gegen Decoction for fourweeks.The changes of RNSand AchR-Ab were observed in each group before and after treatment.RESULTS As compared with the control group before the treatment，RNS level in model rats decreased more.As compared with themodel group after the treatment，RNS recession level in Prednisone and Compound Gegen Decoction groups showed more recoveries，but the latter was inferior to the former.As compared with the control group before the treatment，AchR-Ab level inmodel rats was obviously higher（P＜0.01）.After the treatment，AchR-Ab level in Compound Gegen Decoction and Prescription groups showed markedly lower（P＜0.05），but the former was less than the latter（P＜0.05）.

CONCLUSION Compound Gegen Decoction can promote the improvement of muscle strength in rats with

EAMG.

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种常见的神经科疑难病之一，其病变部位主要在神经肌肉接头突触上，是由乙酰胆碱受体参与的自身免疫性疾病［1］。据报道MG患病率为 （77～150）/ 100万，年发病率为 （4～11） /1万［2］，发病人群多集中于10岁以下儿童或50岁以上老人［3-4］。本实验通过观察葛根复方对重症肌无力大鼠的治疗效果，研究中药对腓肠肌重复性神经刺激电位和乙酰胆碱受体抗体的影响，以期能进一步探讨重症肌无力的致病机理。

1 材料与仪器

1.1 药物 葛根复方 （葛根20 g，黄芪15 g，丹参15 g，苍术15 g，黄柏15 g，牛膝15 g，薏仁15 g），复方组成及药物用量参考 《方剂学》［5］及 《中药学》［6］。药物购买于陕西中医学院药房，药物质量浓度按要求浓缩。大鼠用量参照 《现代医学实验动物学》［7］，为临床用量的 6.25倍。强的松（浙江仙琚制药股份有限公司，生产批号国药准字H33021207）配置为0.54 mg/m L质量浓度的混悬液。

1.2 动物 Lewis大鼠100只，雌性，8周龄大，SPF级，体质量160～180 g，平均 （167.56± 13.34）g，动物来自西安交通大学医学实验动物中心，许可证编号SCXK（陕）2013—001。随机将动物分为4组，分别为：正常组、模型组、强的松组、葛根复方组，每组25只。

1.3 试剂与仪器 鼠源性AchRα亚基97～116肽段（rat-derived 97～116 peptide of the AchRα-subunit），购自南京金斯瑞生物科技有限公司。完全弗氏佐剂 （CFA），不完全弗氏佐剂 （IFA），磷酸缓冲盐 （PBS），0.2%的羧甲基纤维素钠，氨水，乙醇，生理盐水，水合氯醛，酶联免疫吸附剂测定试剂（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），PowerLab数据采集分析系统（PowerLab data recording&analysis system）由上海埃德仪器国际贸易有限公司提供。

2 方法

2.1 造模 除正常组外，模型组、强的松组、葛根复方组均给予两次免疫处理进行造模。配置200μL含有100μg鼠源性AchRα亚基97～116肽段的CFA和PBS的混合乳液，于大鼠四肢足垫和腹部皮下注射，正常组注射等量PBS。30 d后进行第二次加强免疫，将200μL含有50μg鼠源性AchRα亚基97～116肽段的IFA和PBS混合乳液同样皮下注射。

2.2 给药 造模成功的75只大鼠 （造模成功率为100%）进行治疗。强的松组剂量5.4 mg/（kg.d），葛根复方组剂量11.46 g/（kg.d），大鼠给药体积为10 mL/kg，连续灌胃治疗4周。

3 指标检测

3.1 体质量的观察 初次免疫之后，记录大鼠饮食、饮水、体质量变化情况。

3.2 肌力的测定 在末次免疫出现明显肌无力症状后采用Lennon［8］的肌力评分标准评分。0分，无明显无力表现；1分，爬动无力或叫声减少；2分，明显无力，前肢屈曲，躬背低头，被捉时挣扎；3分，严重全身无力，没有叫声或爬动，呈濒死状态。介于四者之间者打0.5、1.5、2.5分。

3.3 肌电图检测 明显肌无力症状出现后，麻醉大鼠，采用生物电信号20μV，3、5、10 Hz低频给予刺激，刺激电极插入坐骨神经附近肌肉处，记录电极插入同侧腓肠肌处，参考电极插入腹部皮下，继续记录5 s，观察衰减程度。

3.4 AchR-Ab检测 治疗前后，均静脉采血，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定。

3.5 统计学分析 采用统计软件SPSS 13.0作为统计工具，实验数据用表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析 （one-way ANOVA），以P＜0.05为有统计学差异。

4 结果

4.1 大鼠体质量的变化 第0周，造模前，各组大鼠的体质量比较差异无统计学意义 （P＞0.05）；第4周，第一次造模结束，各造模组大鼠的体质量增长速度开始减缓，各造模组大鼠体重量差异无明显统计学差异 （P＞0.05）；第6周，第二次造模结束，各造模组大鼠的体质量明显低于正常组大鼠，差异有统计学意义 （P＜0.05），各造模组间比较差异无统计学意义 （P＞0.05）；第10周，药物治疗结束后，葛根复方组和强的松组的体质量增长速度又有所增加，但模型组大鼠体质量未见增加，甚至出现负增长，葛根复方组和强的松组大鼠

体质量要明显高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；葛根复方组大鼠的体质量和强的松组比较，葛根复方组明显高于强的松组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。结果见表1。

表1 葛根复方对大鼠体质量的影响Tab.1 Effects of Com pound Gegen Decoction on the body weights of Lew is rats

表1 葛根复方对大鼠体质量的影响Tab.1 Effects of Com pound Gegen Decoction on the body weights of Lew is rats

注：与正常组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与强的松组比较，●P＜0.05

组别 第0周体质量/g 第4周体质量/g 第6周体质量/g 第10周体质量/g正常组模型组强的松组葛根复方组168.56±13.35 170.21±14.52 172.14±15.25 174.31±14.72 227.64±2.14 214.53±3.69 220.62±5.83 219.25±2.66 266.43±3.23 227.11±2.34△235.34±2.13△232.19±4.53△300.23±3.46 227.75±4.42 270.12±3.38*288.47±3.64**●

4.2 Lennon肌力评定 免疫加强后大鼠出现叫声低弱，反应迟钝，活动量明显减少，毛发干枯发暗，蜷缩弓背症状，肌无力比较明显，按照Lennon肌力评价方法给予评分，结果显示治疗前模型制备各组老鼠与正常组比较，肌无力症状明显，统计学有显著差异 （P＜0.05），各模型制备组之间差异无统计学意义 （P＞0.05）。治疗一月结束后，葛根复方组和强的松组的肌无力症状明显改善，和模型组比较评分差异有统计学意义 （P＜0.05）；葛根复方组的肌力改善情况优于强的松组，两组评分比较差异有统计学意义 （P＜0.05）。结果见表2。

表2 葛根复方治疗前后大鼠的临床Lennon评分比较Tab.2 Compound Gegen Decoction on the cIinicaI symptom s of the pre-therapeutic and post-therapeutic Lew is rats

表2 葛根复方治疗前后大鼠的临床Lennon评分比较Tab.2 Compound Gegen Decoction on the cIinicaI symptom s of the pre-therapeutic and post-therapeutic Lew is rats

注：与正常组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与强的松组比较，●P＜0.05

组别 动物数 治疗前 治疗后正常组25 0.0±0.0 0.0±0.0模型组 25 1.7±0.3△ 1.2±0.4强的松组 25 1.8±0.2△ 0.9±0.2*葛根复方组 25 1.5±0.5△ 0.5±0.3**●

4.3 肌电图测定 治疗前，大鼠在麻醉情况下，用3、5、10 Hz重复电刺激大鼠腓肠肌，截取20 μV/0.01 s，5 Hz视图观察，正常组大鼠肌电图波幅无明显变化，造模各组大鼠肌电图波幅衰减程度均超过10%，造模各组和空白组比较，差异有统计学意义 （P＜0.05），各造模组间比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）；治疗后同样方法测得强的松组大鼠和葛根复方组大鼠肌电图波幅衰减程度都有所恢复，和模型组比较明显升高，差异有统计学意义 （P＜0.05），说明治疗有效；治疗后与强的松组比较，葛根复方组的肌电图波幅衰减程度恢复更好，比较差异有统计学意义 （P＜0.05），说明葛根复方组的治疗效果比强的松显著。结果见表3、图1、图2。

表3 葛根复方治疗前后大鼠的腓肠肌肌电平均振幅比较Tab.3 Com pound Gegen Decoction on eIectrom yography of gastrocnem ius of the pre-therapeutic and posttherapeutic Lewis rats

表3 葛根复方治疗前后大鼠的腓肠肌肌电平均振幅比较Tab.3 Com pound Gegen Decoction on eIectrom yography of gastrocnem ius of the pre-therapeutic and posttherapeutic Lewis rats

注：与正常组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与强的松组比较，●P＜0.05

组别 动物数 治疗前 治疗后正常组25 19.7±1.3 19.3±1.0模型组 25 6.2±0.9△ 6.5±0.4强的松组 25 5.7±0.8△ 15.9±0.6*葛根复方组 25 5.5±0.5△ 17.7±0.7**●

4.4 AchR-Ab检测 药物治疗前后分别检测大鼠血液中AchR-Ab的量。治疗前各造模组大鼠AchRAb的量与正常组比较明显偏高，差异有统计学意义 （P＜0.05），各造模组间比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）；药物治疗后，强的松组和葛根复方组大鼠AchR-Ab的量比起模型组明显降低，差异有统计学意义 （P＜0.05）；葛根复方组和强的松组比较，葛根复方组AchR-Ab的量较低，差异有统计学意义 （P＜0.05）。结果见表4。

表4 葛根复方治疗前后大鼠血清中AchR-Ab表达水平比较Tab.4 Com pound Gegen Decoction on the exp ressions of AchR-Ab in serum of the pre-therapeutic and posttherapeutic Lew is rats

表4 葛根复方治疗前后大鼠血清中AchR-Ab表达水平比较Tab.4 Com pound Gegen Decoction on the exp ressions of AchR-Ab in serum of the pre-therapeutic and posttherapeutic Lew is rats

注：与正常组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与强的松组比较，●P＜0.05

组别 动物数 治疗前 治疗后正常组25 0.73±0.04 0.72±0.03模型组 25 6.13±0.43△ 6.25±0.49强的松组 25 6.18±0.35△ 3.32±0.12*葛根复方组 25 6.21±0.36△ 2.05±0.06**●

5 讨论

图1 治疗前大鼠腓肠肌肌电图Fig.1 EIetrom yogram s of gastrocnem ius of the pre-therapeu tic Lew is rats

图2 治疗后大鼠腓肠肌肌电图Fig.2 EIetrom yogram s of gastrocnem ius of the post-therapeu tic Lew is rats

重症肌无力作为一种自身免疫性疾病，其发病源于神经肌肉接头处 （NMJ）传递性功能障碍，NMJ突触后膜上的AchR自身抗体介导的特异性自

身免疫阻断了神经信号的传递，产生了一系列的骨骼肌疲劳症状［9］。目前对重症肌无力的治疗大多采用胆碱抑制剂、免疫抑制剂等，主要通过抑制这种自身免疫反应，恢复神经肌肉信号传播，来缓解肌无力症状。但是治疗效果不佳，仍有待进一步探讨治疗。

RNS检查是目前最能反应NMJ神经电生理变化的检查方法，由于神经突触受体自身免疫损伤，神经冲动信号的传播受到影响，所以生理肌电的检测结果可以反映出肌无力症状的轻重［10］。检测时以波幅衰减率大于等于10%为阳性［11］，目前RNS衰减率已经作为常用的诊断肌无力的方法，振幅衰减程度越大临床表现肌无力症状越明显。

乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）是最早发现的MG患者检测指标之一，这种由自身受体病变而产生的阻断性抗体在MG诊断当中已经作为一项最重要指标，虽然目前显示并非所有患者都会有血清抗体阳性反应，但是大多数肌无力患者血清中抗体的数量越多，表现出的肌无力症状就越严重，其滴度的大小还和疾病的严重程度呈正向相关，因此抗体的检测一直受到高度重视，也已经建立了标准化的检测方法，得到了广泛的定性和定量的分析［12］。

近年来运用中医理论治疗重症肌无力已经显现出一定的优势。重症肌无力在中医中属于 “痿证”范畴，发病机理主要为脾虚不运，水湿停滞，瘀血阻滞，机体气血运行受阻，出现虚实夹杂的病证［13］。辨证治法应以益气健脾，清热利湿，活血化瘀等治法为主。本研究选取葛根、黄芪、丹参、苍术、黄柏、牛膝、薏仁的配伍来治疗，以期通过健脾燥湿，活血通脉来改善肌无力症状。葛根入阳明经，可通行气血，输肌活络，解肌驱邪；黄芪入脾入肺，益气健脾，气充则健运，气行则脉通，瘀阻自可畅达；丹参入血入络，可行气活血，祛瘀生新，清热凉血，疏通经络［14］；黄柏苦寒，苦能燥湿，寒以清热，入下焦；苍术辛、苦温，辛发散祛风，苦温能燥湿；薏仁甘淡、性寒，健脾利湿除痹利筋络；牛膝苦、性酸平，活血化瘀，引药下行，补益肝肾利关节强筋骨。四味合用，为燥湿健脾，活血通络，治湿热痿证之妙剂［15］。全方以健脾益气为主，兼可清热利湿，活血通络，正邪兼顾，攻补兼施，为治疗因脾虚湿热瘀阻而致肌无力的重要方。

本实验通过中药复方治疗实验性重症肌无力大鼠，观察肌无力大鼠体质量的变化情况、肌力的变化情况和肌无力血清中相关因子AchR-Ab变化情况。结果显示，葛根复方在治疗肌无力大鼠中效果显著，对大鼠体质量、肌力恢复、血清中相关因子AchR-Ab的表达都有显著改善。本研究说明中药葛根复方配伍对肌无力大鼠的症状有明显改善，显示出了优于西药的治疗效果，这将为中药治疗重症肌无力提供实验基础，为进一步筛选有效的中医药方治疗肌无力提供帮助。

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Effect of Compound Gegen Decoction on RNS and AchR-Ab in rat serum w ith experim entaIautoimm une myasthenia gravis

WEN Ying-juan， YANG Jun-chao

（Shanxi Gollege of Traditional Ghinese Medicine，Xianyang 712046，Ghina）

AIM To research the effect of Compound Gegen Decoction（Puerariae lobatae Radix，Astragali Radix，Salviaemiltiorrhizae Radix et Rhizoma，Atractylodis Rhizoma，Phellodendri chinensis Cortex，etc.）on gastrocnemius repetitive nerve stimulation（RNS）and the expression of acetylcholinereceptor antibodies（AchR-Ab）in rat serum with experimental autoimmunemyasthenia gravis（EAMG）and itsmechanism of action.METHODS

experimental autoimmune myasthenia gravis（EAMG）；Compound Gegen Decoction；repetitive nerve stimulation（RNS）；acetylcholine receptor antibodies（AchR-Ab）

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2357-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.005

2014-10-09

国家自然科学基金项目 （81202642）；陕西省重点学科建设项目 （2014）

文颖娟 （1973—），女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为脾胃病证方药。Tel：13609108884，E-mail：wenyuyao2003@ 163.com