大肠埃希菌蛋白指纹诊断模型临床应用价值的验证

姜 伟，肖代雯，杨永长，刘 华，喻 华，黄文芳，李顺君

四川省医学科学院·四川省人民医院 检验科（成都 610072）

大肠埃希菌（Escherichia coli，ECO）是重要的医院感染致病菌，可通过接触、呼吸道气溶胶吸入或侵入性操作等引起菌血症或呼吸道、尿路及伤口感染等，给临床治疗造成极大困难［1－3］。目前国内外研究通常采用管家基因（如16SrRNA）测序法鉴定病原微生物，但该方法耗时较长、操作繁琐［4］。蛋白质指纹技术是近年发展起来的一种实验检测技术，具有操作简便、快速、高通量、高灵敏性和高特异性的特点，主要用于分子或基因水平疾病（如肿瘤）的早期检测。本研究基于实验室前期已建立的蛋白指纹技术与Fingerwave软件结合的ECO快速诊断模型［5］，利用新近收集的临床标本进行盲法验证，以期为该技术的应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

收集四川省医学科学院·四川省人民医院各科室2014年1－12月临床标本分离的菌株163株，经VITEK－2全自动微生物分析仪鉴定，其中ECO 81株，鲍曼不动杆菌22株，肺炎克雷伯菌20株，铜绿假单胞菌15株，表皮葡萄球菌10株，金黄色葡萄球菌9株，阴沟肠杆菌6株。参考株为ECO株ATCC25922。

提取81株ECO细菌DNA，利用PCR技术扩增细菌体内蛋白分子伴侣DnaJ编码基因，扩增长度约为719bp［5］。PCR产物纯化后测序，所得产物序列与NCBI中基因数据库进行比对。

1.2 细菌培养

葡萄球菌和革兰阴性杆菌分别接种于血平板和麦康凯琼脂平板（安图公司）［6］，于 35 ℃、6.5%CO2培养24h，然后挑取单个菌落再次接种于上述平板中，相同环境下培养24h。用接种环收集细菌至1.5mL离心管中，无菌双蒸水洗涤3次，然后1 500r/min离心5min，离心半径5cm，弃去上清，留取沉淀用于细菌蛋白提取。

1.3 细菌蛋白指纹图谱检测

参照我们前期研究方法［6］进行细菌蛋白提取、PBSⅡ－C型蛋白质芯片阅读仪（Bio－Rad公司）参数设置及校正、蛋白指纹图谱检测。

1.4 获取细菌蛋白指纹数据

采用Proteinchip软件对数据进行均一化处理，将标准系数0.3～3.0的图谱纳入分析。统计前期筛选的19个标志蛋白表达丰度，将其数据导入自建的Fingerwave软件，设置鉴定阈值为0.7［5］。当预测值≥0.7，归为ECO；当预测值＜0.7，归为其他细菌。将模型鉴定结果与其他传统方法及分子生物学方法进行比较，计算灵敏度、特意度和符合率，评价模型诊断效能。

1.5 头孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐药的ECO蛋白指纹图分析

头孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦是临床治疗ECO感染的首选药物［7］。筛选所收集菌株中对以上药物均耐药（9株）和均敏感（45株）的ECO蛋白指纹图谱数据，对比分析两组细菌蛋白表达的差异性。

2 结果

2.1 DnaJ基因测定结果

ECO的DnaJ基因扩增产物均扩增出目的条带（图1）。结果显示与ECO符合率＞99%，确定为ECO（AB272648）。

图1 ECO的DnaJ编码基因PCR扩增产物电泳图

2.2 蛋白标志物在两次检测中的表达差异

ECO蛋白指纹图谱（图2）导入Biomarker Wizard软件，对蛋白表达数据分析后发现29个所有细菌共同表达的蛋白质峰。统计前期筛选的19个标志蛋白质峰的表达丰度，除15 724蛋白质峰在本次检测中表达略有增高外，其余蛋白质峰的表达均降低，表达丰度为2.55～30.90（表1）。

表1 筛选的19个ECO标志蛋白表达在两次检测中的表达差异

2.3 ECO蛋白指纹数据模型的建立及评价

81例ECO中有9例判错，82例其他细菌中有13例判错。ECO蛋白指纹诊断模型检测ECO的敏感度为88.9%（72/81），特异度为84.1%（69/82），符合率为86.5%（141/163）。

2.4 耐药/敏感ECO蛋白表达的差异性

两组差异蛋白质峰有7个；与敏感菌株比较，耐药菌株中表达增高的蛋白质峰4个，分别为9 068、11 994、17 442、18 820m/z；表达降低的蛋白质峰3个，分别为7 485、8 597、15 901m/z。

图2 两次检测获得的部分ECO蛋白指纹图谱比较

3 讨论

ECO已成为医院感染的主要病原菌之一，其检出率仅次于铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌。目前，开发快速鉴定ECO感染的新技术或新方法，是临床微生物学研究的重点之一［5］，从蛋白分子水平来检测和鉴定病原微生物是其主要的研究方向。Bader［8］利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）技术鉴定了部分革兰阳性和阴性细菌，结果表明，同种细菌间蛋白的表达相近，具有相似的蛋白指纹图，因此根据细菌的蛋白指纹图可快速鉴定细菌。我们前期的研究［5－6］也证明利用蛋白指纹图谱技术及自建的Fingerwave软件可快速鉴定多种细菌。本研究是对前期建立的ECO蛋白指纹数据模型的再次验证，结果显示该检测模型对ECO的检测灵敏度和特异度分别为88.9%和84.1%，与传统微生物学方法及分子生物学方法相比，符合率为86.5%。

我们两次检测均采用相同方法提取和处理细菌蛋白，使用相同的检测仪器和参数。但是，与前期研究检测结果相比，本研究获得的部分蛋白指纹图中的蛋白质峰数目有所减少，聚类分析后只得到29个共有蛋白质峰，并且筛选的19个标志蛋白中有18个存在表达降低，只有15 724蛋白质峰表达略有增高，这可能与激光发射器的检测效能下降有关。因此，在使用蛋白指纹图谱仪的过程中，监测和保证激光发射器的效能，建立标准化实验流程和质量控制规则，对于保证实验的重复性非常重要。本次研究ECO的鉴定符合率为86.5%，与前期研究结果（100.0%）相比，有所下降，提示建库筛选的蛋白标志物可能需进一步优化，但也可能是由于同种细菌间蛋白表达的差异性和多样性导致。本研究对比分析了对头孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐药或敏感的两组ECO蛋白指纹图，发现7个差异表达的蛋白质峰，表明蛋白指纹图谱分析对于指导临床合理使用抗生素也具有潜在应用价值。

此外，两次研究分析后也发现蛋白指纹图谱检测存在一些不足：1）研究平台相对复杂且成本较高；2）筛选的差异蛋白还需要进一步鉴定，以确定蛋白的本质。

综上所述，利用蛋白指纹图谱技术鉴定ECO，具有简单、快速、高通量的特性，在临床微生物检测中具有潜在应用价值，但需进一步优化建库的各细菌蛋白质峰谱，建立标准操作流程和质控规则，并对确立的模型进行大样本量和多中心的验证。

［1］Yamasaki S，Wang LY，Hirata T，et al.Multidrug efflux pumps contribute to Escherichia coli biofilm maintenance［J］.Int J Antimicrob Agents，2015，45（4）：439－441.

［2］Ahangarkani F，Rajabnia R，Shahandashti EF，et al.Frequency of class 1integron in Escherichia coli strains isolated from patients with urinary tract infections in north of iran［J］.Mater Sociomed，2015，27（1）：10－12.

［3］GörgeçS，KuzucuÇ，Otlu B，et al.［Investigation of betalactamase genes and clonal relationship among the extendedspectrum beta－lactamase producing nosocomial Escherichia coli isolates］［J］.Mikrobiyoloji Bulteni，2015，49（1）：15－25.

［4］Khamis A，Raoult D，La Scola B.Comparison between rpoB and 16SrRNA gene sequencing for molecular identification of 168clinical isolates of Corynebacterium［J］.Journal of Clinical Microbiology，2005，43（4）：1934－1936.

［5］肖代雯，喻华，杨永长，等.表面增强激光解析电离飞行时间质谱快速鉴定血液大肠埃希菌感染［J］.临床检验杂志，2013，31（5）：349－352.

［6］肖代雯，杨永长，喻华，等.大肠埃希菌蛋白指纹图谱的建立［J］.中国微生态学杂志，2008，20（5）：472－474.

［7］喻华，刘华，黄文芳，等.四川省细菌耐药监测网2012年细菌耐药性监测［J］.中国抗生素杂志，2014，39（5）：332－337.

［8］Bader O.MALDI－TOF－MS－based species identification and typing approaches in medical mycology［J］.Proteomics，2013，13（5）：788－799.