金属硫蛋白2A重组质粒的构建及其在血管内皮细胞中的表达＊

杨 汀，刘海荣，李家丽，刘月明

成都医学院第一附属医院 烧伤整形科（成都 610000）

金属硫蛋白（metallothionein，MT）是一种存在于细胞中的低分子量、具有金属结合特性的蛋白质［1］。在哺乳动物体内存在4种亚型，包括 MT－1、MT－2、MT－3和 MT－4［2］，具有调节金属离子代谢、清除自由基、抗氧化、抗细胞凋亡以及稳定细胞质膜和亚细胞器被膜等功能，参与DNA复制、转录，影响蛋白质和能量代谢等［3－6］。Espejo等［7］发现 MT基因敲除小鼠对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的炎症反应比对应的野生型小鼠更敏感，提示MT在LPS引起的炎症损伤中可能发挥保护作用，但具体机制目前尚不清楚。MT－2是MT家族中重要的组成成分，分为MT2A和MT2B两种亚型，参与细胞增殖、分化和凋亡等过程，并与炎症、癌症以及呼吸系统和神经系统疾病密切相关［8－10］。我们前期研究发现，MT2A与内皮高表达脂多糖相关因子1 基 因（endothelial－overexpressed lipopolysaccharide－associated factor 1，EOLA1）存在相互作用，并与LPS损伤人脐静脉内皮细胞（HUVECs）过程有关［11］。本研究构建 MT2A强制表达载体，并成功转染HUVECs，建立MT2A上调表达细胞模型，为进一步研究MT2A在内皮细胞炎症损伤中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HUVECs（美国 ATCC公司）；细胞培养基DMEM（GIBCO 公司）；pEGFP－N1质粒由成都医学院生物医学系实验中心提供；XhoI、KpnI酶切酶（Themor公司）；cDNA模板（上海英骏生物技术有限公司）；连接酶（Themor公司）；质粒提取试剂盒及PCR产物回收试剂盒（OMEGA公司）；高纯总RNA快速提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）；Revert AidFirst Strand cDNA Synthesis kit（Thermo公司）；Lipofectamine脂质体（Invitrogen公司）；兔抗人（一抗）（Abcam公司）；羊抗兔（二抗）（Invetrogen公 司）；凝 胶 成 像 系 统（BIO－RED 美国）；荧光倒置显微镜（Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 pEGFP－N1－MT2A载体构建 根据 MT2A ORF序列采用Primer 5.0软件设计引物。MT2AF：CCTCGAGGATGGATCCCAAC，其 5＇端包含XhoI酶切位点；MT2A－R：GGGTACCCGGCGCA GCAG，其5＇端包含KpnI酶切位点，由上海英骏生物技术有限公司合成。用所设计引物扩增MT2A ORF序列，反应体系共50μL，其中 MT2A－F和MT2A－R各1μL、cDNA模板1μL、master mix 25 μL，加水至50μL。反应条件：94℃3min，94℃10 s，49℃30s，72℃15s循环35次，72℃5min。将PCR产物进行凝胶电泳，用PCR纯化试剂盒将扩增成功的PCR产物的扩增片段全部回收纯化。PCR产物和pEGFP－N1载体进行双酶切，酶切产物琼脂糖电泳后回收纯化，连接酶连接，连接条件：22℃30min，65℃10min。将连接产物转化至DH5α中并培养，37℃过夜，挑取单克隆菌落培养并抽提质粒。对质粒进行酶切和测序鉴定。

1.2.2 pEGFP－N1－MT2A 质粒转染及观察 铺6孔板，每孔约2×106个细胞，待细胞生长到培养板80%时进行转染；取2.5μg pEGFP－N1－MT2A 加入1.5mL EP管中，加入100μL MEM1无血清培养基，此为1号管；另取1.5mL EP管加入100μL MEM1无血清培养基，缓慢加入6μL Lipofectamine脂质体，轻轻混匀，此为2号管；将1号管混合物缓慢加入2号管中，室温静置20min；用无血清培养基洗HUVECs两次，加入1mL MEM1无血清，将两管混合液缓慢加入六孔板中，37℃培养4～5h，后补加20%胎牛血清培养液1 mL继续培养48h；将转染细胞放置于激发波长为488nm的荧光倒置显微镜下观测EGFP在HUVECs中的分布情况。

1.2.3 RT－PCR 检测 MT2AmRNA 表达水平设立pEGFP－N1－MT2A转染组、pEGFP－N1转染组和空白对照组。收集各组细胞，在无RNA酶条件下提取总RNA并反转录成cDNA。据MT2A基因设计引物，MT2A－F：CACCACGCCTCCTCCAAG；MT2A－R：CGCAGGAGCAGTTGGGATC。反 应体系共50μL，其中SYBR Green 25μL、MT2A－F 1 μL、MT2A－R 1μL、cDNA 2μL、去核酸水21μL。反应条件：95℃10min，95℃15s，62℃20s循环40次。根据CT值，计算各组MT2A含量。实验重复3次。

1.2.4 Western blot检测 MT2A表达 设立pEGFP－N1－MT2A转染组、pEGFP－N1转染组和空白对照组。收集各组细胞，预冷PBS洗3次，吸尽残留液，加入适量体积的细胞裂解液，冰上裂解1 h，13 000rpm 4℃ 离心30min，收集上清转移至EP管中，即为细胞总蛋白。BCA法进行蛋白浓度测定：调整样品浓度，以每孔80μg蛋白加样，加入等量体积4×SDS上样缓冲液，煮沸10min，SDSPAGE胶电泳，电泳分离后的蛋白电转至0.22μm PVDF膜上，用脱脂牛奶封闭，加一抗4℃孵育过夜，TBST洗6次，每次5min，加二抗37℃孵育1 h，TBST洗5次，每次10min，用ECL发光法测定蛋白表达情况。实验重复3次。

2 结果

2.1 MT2A的ORF扩增

PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现在略小于200bp处（目的蛋白大小为186bp）有一清晰条带，说明MT2A的ORF扩增成功（图1）。

图1 MT2A的ORF扩增（M：DNA Mark；1：MT2A基因ORF）

2.2 重组质粒的酶切与测序鉴定

pEGFP－N1－MT2A重组载体经过XhoI和Kpn I双酶切后，电泳可见大小为4 700bp、186bp的DNA条带，与理论值一致，初步验证pEGFP－N1－MT2A构建成功（图2）。经酶切验证的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果显示：重组质粒中MT2AORF序列与Genebank中的序列一致（图3）。

图2 重组质粒pEGFP－N1－MT2A的酶切分析（M：DL5000mark；1：重组质粒pEGFP－N1－MT2AORF）

图3 MT2A基因测序结果

2.3 pEGFP－N1－MT2A在HUVECs中的转染情况

转染48h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞，可见绿色荧光表达，72h到达高峰，细胞计数计算转染效率约为70%（图4）。

图4 pEGFP－N1－MT2A转染HUVECs细胞

2.4 MT2AmRNA表达水平

pEGFP－N1－MT2A转染组、pEGFP－N1转染组和空白对照组3组细胞RT－PCR检测显示：pEGFP－N1－MT2A转染组条带明显高于pEGFPN1转染组和空白对照组（图5）。经荧光定量PCR仪附带软件分析，pEGFP－N1－MT2A 转染组2－△△Ct值为1.267±0.064，方差分析结果显示其2－△△Ct值明显高于pEGFP－N1转染组和空白对照组（P＜0.05）（表1）。

图5 MT2AmRNA表达水平

表1 3组细胞MT2AmRNA表达水平

2.5 MT2A蛋白表达情况

pEGFP－N1－MT2A转染组、pEGFP－N1转染组和空白对照组3组细胞Western blot检测显示：pEGFP－N1－MT2A转染组条带明显高于pEGFPN1转染组和空白对照组（图6），经Qualityone图像处理软件定量分析，pEGFP－N1－MT2A转染组灰度值为（1.728±0.064），方差分析结果显示，其灰度值明显高于pEGFP－N1转染组和空白对照组（P＜0.05）（表2）。

图6 MT2A蛋白表达水平

表2 3组细胞的灰度值

3 讨论

严重烧创伤患者由于外源性细菌感染或肠源性细菌和内毒素移位，易诱发脓毒症（sepsis），引起全身性炎症反应综合症（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），临床上预防和治疗十分棘手，目前为止仍是大面积烧伤、严重创伤最主要的死亡原因［12］。目前已证实LPS是脓毒症的主要启动子，LPS激活内皮细胞是一复杂的病理生理过程，包括特异受体的感知、刺激信号的内传、胞内信号的转导以及相关基因的表达和细胞表型的改变。由于LPS在炎症反应发生发展过程中起主导作用，近几十年来有大量研究试图通过加入外源性物质对抗LPS，从而控制炎症反应，研究方向主要集中在中和、拮抗和竞争性抑制LPS，但在治疗脓毒症方面未取得令人满意的效果［13］。因此，研究机体对LPS刺激产生的内源性保护反应及其机制显得越发重要。

MT是机体重要的自我保护性蛋白，其中MT2A在清除氧自由基、抑制炎症反应等方面有重要作用，我们前期研究结果也证实MT2A可减轻内皮 细 胞 LPS 损 伤［11］。Eckschlager 等［14］指 出MT2A的过度表达是多种肿瘤对放疗、化疗产生耐药性的重要原因，这反映了MT2A在抵抗细胞损伤方面的强大作用。为进一步研究MT2A在内皮细胞炎症反应中的作用，必须建立可调控MT2A表达的细胞模型。本实验通过扩增MT2A的ORF片段，构建重组表达质粒pEGFP－N1－MT2A，重组质粒通过测序验证。将重组质粒转染至HUVECs中，荧光显微镜下观察转染细胞呈绿色，证实转染成功。用 RT－PCR 和 Western blot实 验 检 测HUVECs中MT2AmRNA和MT2A蛋白的表达水平，结果显示，pEGFP－N1－MT2A组高于空白对照组及pEGFP－N1组，证明可通过重组质粒转染的方式成功构建MT2A上调表达细胞模型。本研究为进一步探索MT2A在炎症中的作用机制奠定了基础。

［1］Freisinger E，Vašák M.Cadmium in metallothioneins［J］.Met Ions Life Sci，2013，11：339－371.

［2］Kayaalti Z，Aliyev V，Soylemezoglu T.The potential effect of metallothionein 2A－5A／G single nucleotide polymorphism on blood cadmium，lead，zinc and copper levels［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，256（1）：1－7.

［3］Vasak M.Advances in metallothionein structure and functions［J］.J Trace Elem Med Biol，2005，19（1）：13－17.

［4］Penkowa M. Metallothioneins are multipurpose neuroprotectants during brain pathology［J］.FEBS J，2006，273（9）：1857－1870.

［5］Mehus AA，Muhonen WW，Garrett SH，etal.Quantitation of human metallothionein isoforms：a family of small，highly conserved，cysteine－rich proteins［J］.Mol Cell Proteomics，2014，13（4）：1020－1033.

［6］Vasak M，Meloni G.Chemistry and biology of mammalian metallothioneins［J］.J Biol Inorg Chem，2011，16（7）：1067－1078.

［7］Espejo C，Penkowa M，Demestre M，etal.Time－course expression of CNS inflammatory，neurodegenerative tissue repair markers and metallothioneins during experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Neuroscience，2005，132（4）：1135－1149.

［8］Sutherland DE，Stillman MJ.The"magic numbers"of metallothionein［J］.Metallomics，2011，3（5）：444－463.

［9］Swindell WR.Metallothionein and the biology of aging［J］.Ageing Res Rev，2011，10（1）：132－145.

［10］Thirumoorthy N，Manisenthil Kumar KT，Shyam Sundar A，etal. Metallothionein：an overview ［J］. World J Gastroenterol，2007，13（7）：993－996.

［11］Liu Y，Liu H，Chen W，etal.EOLA1protects lipopolysaccharide induced IL－6production and apoptosis by regulation of MT2Ain human umbilical vein endothelial cells［J］.Mol Cell Biochem，2014，395（1－2）：45－51.

［12］Moore EC，Padiglione AA，Wasiak J，etal.Candida in burns：risk factors and outcomes［J］.J Burn Care Res，2010，31（2）：257－263.

［13］Nahra R，Dellinger RP.Targeting the lipopolysaccharides：still a matter of debate？［J］.Curr Opin Anaesthesiol，2008，21（2）：98－104.

［14］Eckschlager T，Adam V，Hrabeta J，etal.Metallothioneins and cancer［J］.Curr Protein Pept Sci，2009，10（4）：360－375.