退变髓核细胞拉伸实验的形态学研究*

任国梁 牛建鹏 任龙韬 王祺

脊柱退变始于椎间盘，30岁后即可发生，生物力学的改变及外力的作用使椎间盘退变进一步加剧，引起纤维环撕裂最终导致椎间盘膨出或突出而出现一系列临床症状[1]。腰椎间盘突出症是一种常见多发病，以腰痛、下肢放射性疼痛为特点，可严重影响患者的工作和生活，大多数患者可以通过非手术治疗取得满意的疗效[2]。牵引治疗腰椎间盘突出症有明显效果，是非手术治疗腰椎间盘突出症的主要方法之一。椎间盘体内环境复杂，互相影响因素多，研究其退变机制比较困难。但将椎间盘细胞或组织分离出来并置于人工环境中培养制备模型，能够排除干扰因素而针对单因素研究，容易控制人为干预，是研究椎间盘退变机制及其治疗的好方法[3]。本研究通过对人退变髓核细胞的拉伸来模拟临床中牵引治疗腰椎间盘突出症，比较拉伸前后退变髓核细胞形态学及细胞数量的变化，结合临床牵引对椎间隙拉伸幅度的改变，为临床上腰椎间盘突出症牵引治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 退变髓核细胞的拉伸实验

1.1.1 髓核细胞的培养 选择2012年9-12月在本科手术治疗的腰椎间盘突出症志愿者60例，男30例，女30例，年龄55～67岁。取术中废弃髓核组织（伦理委员会审核同意）经病理检查证实为退变椎间盘组织，于无菌条件下提取髓核细胞并原代培养[4-5]，培养7～15 d，待细胞贴满瓶底且呈类圆形或梭形时，经处理后吹匀细胞并接种到BioFlex细胞培养板，于恒温37 ℃、恒湿的CO2孵箱内继续培养48 h，高倍镜下观察细胞形态。

1.1.2 Flexcercell 4000柔性基底拉伸系统的组成及原理 采用美国Flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置（F4000 tension，太原理工大学生物力学实验室），本装置由计算机控制器、负压输出控制器、负压真空泵、基底板、密封垫、载入平台及BioFlex培养板组成，用来对体外培养的组织或细胞施加拉伸。该系统是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜，形成负压而使培养膜产生拉伸应力，使黏附生长的细胞受到拉伸张力的作用[6]。细胞所受力的大小与培养膜的牵拉幅度呈正比，整个加载装置放置于恒温37 ℃、恒湿的CO2孵箱内，加载程序由F4000软件自动控制。

1.1.3 加载程式 程式：胶原I型基底膜；空白对照组（A组）、5%拉伸幅度组（B组）、10%拉伸幅度组（C组）及15%拉伸幅度组（D组）；加载时间24 h，频率0.1 Hz，波形为正弦波。

1.1.4 退变髓核细胞的接种、拉伸 将培养瓶中髓核细胞以1×104个/mL的密度接种到BioFlex培养板上，孵箱内培养48 h，细胞贴壁、融合生长后更换为10%胎牛血清的DMEM/F12高糖培养液，依预定程式进行加载，加载完成后卸载，高倍镜下拍照。

1.2 临床腰椎间盘突出症的牵引实验 对经MRI证实的L3/4、L4/5及L5/S1椎间盘突出症患者（男性志愿者，55岁，体重80 kg），用多功能牵引床分别以体重的20%、30%、35%牵引力（当牵引力达体重的40%时，志愿者无法耐受）各牵引6次，1次/d。检查腰椎间盘突出症的理想手段为CT和MRI，但随着X线设备的发展，CR的出现，诊断精确度越来越高，因此X线检查仍具有重要的临床价值及意义[7]。拍摄牵引前、牵引30 min时床旁腰椎侧位X线片（移动式DR X线机），测量各椎间隙高度。以牵引前L3/4、L4/5及L5/S1椎间隙作标准，比较牵引30 min时各椎间隙高度的变化（%），即得出L3/4、L4/5及L5/S1椎间隙牵引增加的幅度。牵引实验分为三组，即20%体重牵引组、30%体重牵引组和35%体重牵引组，比较三个牵引组经过牵引30 min时各椎间隙增高程度的差异。

1.3 统计学处理 采用PEMS 3.1统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x-±s）表示，三组比较采用方差分析，三组间两两比较采用方差分析，计数资料比较采用x2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牵引实验

2.1.1 牵引前后各组腰3/4的椎间隙高度的比较 由表1可知，牵引前三组腰3/4椎间隙高度无统计学差异（P>0.05），牵引30 min时三组椎间隙高度和牵引前后椎间隙增加幅度均存在统计学差异（P<0.05），表现为20%体重组<30%体重组<35%体重组，且各组牵引前后的椎间隙高度存在统计学差异（P<0.05）。

表1 牵引前后各组腰3/4的椎间隙高度的比较（±s）

表1 牵引前后各组腰3/4的椎间隙高度的比较（±s）

组别 牵引前（mm） 牵引30 min（mm） 椎间隙增加幅度（%） F值 P值20%体重组（n=20） 12.93±0.36 13.57±0.38 5.00±0.04 -80.554 0.000 30%体重组（n=20） 12.93±0.32 14.17±0.38 9.63±0.65 -31.743 0.000 35%体重组（n=20） 12.98±0.35 14.97±0.47 15.26±0.78 -34.159 0.000 F值 0.055 17.278 462.603 - -P值 0.946 0.000 0.000 - -

2.1.2 牵引前后各组腰4/5的椎间隙高度的比较 由表2可知，牵引前三组腰4/5椎间隙高度无统计学差异（P>0.05），牵引30 min时三组椎间隙高度和牵引前后椎间隙增加幅度均存在统计学差异（P<0.05），表现为20%体重组<30%体重组<35%体重组，且各组牵引前后的椎间隙高度存在统计学差异（P<0.05）。

2.1.3 牵引前后各组腰5/骶1的椎间隙高度的比较 由表3可知，牵引前三组腰5/骶1椎间隙高度无统计学差异（P>0.05），牵引30 min时三组椎间隙高度和牵引前后椎间隙增加幅度均存在统计学差异（P<0.05），表现为20%体重组<30%体重组<35%体重组，且各组牵引前后的椎间隙高度存在统计学差异（P<0.05）。

表2 牵引前后各组腰4/5的椎间隙高度的比较（±s）

表2 牵引前后各组腰4/5的椎间隙高度的比较（±s）

组别 牵引前（mm） 牵引30 min（mm） 椎间隙增加幅度（%） F值 P值20%体重组（n=20） 14.86±0.62 15.62±0.65 5.09±0.17 -48.397 0.000 30%体重组（n=20） 14.85±0.21 16.33±0.23 10.00±0.20 -109.179 0.000 35%体重组（n=20） 14.68±0.45 16.87±0.53 14.95±0.26 -58.839 0.000 F值 0.307 9.285 3166.202 - -P值 0.740 0.002 0.000 - -

表3 牵引前后各组腰5/骶1的椎间隙高度的比较（±s）

表3 牵引前后各组腰5/骶1的椎间隙高度的比较（±s）

组别 牵引前（mm） 牵引30 min（mm） 椎间隙增加幅度（%） F值 P值20%体重组（n=20） 8.39±0.43 8.82±0.44 5.23±0.25 -40.679 0.000 30%体重组（n=20） 8.37±0.24 9.23±0.29 10.27±0.37 -41.313 0.000 35%体重组（n=20） 8.37±0.43 9.63±0.50 15.00±0.46 -36.932 0.000 F值 0.003 5.469 1060.092 - -P值 0.997 0.016 0.000 - -

2.2 细胞实验

2.2.1 退变椎间盘髓核细胞拉伸前后比较 图1为拉伸24 h后未经染色的退变髓核细胞：A为对照组；B为5%拉伸幅度；C为10%拉伸幅度；D为15%拉伸幅度。对比退变髓核细胞拉伸前后细胞形态，A组呈类圆形、梭形及星形，且生长滞缓、细胞折光性差，有明显老化现象。与A组相比，B组髓核细胞形态多呈类圆形及梭形，星形及不规则形；C组髓核细胞形态则以类圆形为主，突起沿着细胞长轴的两端且细胞突起短而粗，细胞折光性好；D组髓核细胞形态多呈星形及不规则形，细胞体积增大，核变大，细胞突起呈树枝状向四周伸出，部分突起未端呈喇叭状膨大，且有次级突起，细胞折光性差，接近凋亡状态。

图1 退变椎间盘髓核细胞拉伸前后（×40）

2.2.2 不同组别细胞生长个数的比较 由表4可知，不同组的细胞个数存在统计学差异（F=201.144，P=0.000），表现为10%拉伸幅度组>5%拉伸幅度组>对照组>15%拉伸幅度组。

表4 不同组别细胞生长个数的比较（±s）

表4 不同组别细胞生长个数的比较（±s）

组别 细胞个数（个）对照组（A）（n=15） 59.33±9.69 5%拉伸幅度组（B）（n=15） 109.17±14.08 10%拉伸幅度组（C）（n=15） 177.33±11.94 15%拉伸幅度组（D）（n=15） 34.33±6.31

3 讨论

椎间盘退行性变是引起下腰痛的主要原因[8]。椎间盘退变主要表现在髓核细胞和细胞外基质成分的改变。椎间盘退变源于椎间盘细胞的数量减少和功能异常，继而椎间盘分散脊柱压缩力、维持椎间隙高度的生物力学功能丧失，最终导致椎管狭窄、神经根受压并产生腰腿痛[9]。关于腰椎间盘突出症的治疗，分为非手术疗法和手术疗法，只要严格掌握适应证均有良好疗效。非手术疗法是本病的基础治疗，可使85%～90%的患者治愈或缓解，据10年以上随访功能评价，手术疗法组与非手术疗法组无显著差异性，循证医学尚不足以支持何种治疗方法更好，无优劣之分[10]。

髓核细胞的老化率与椎间盘的退变等级成正相关[11]。正常髓核细胞形态学以类圆形及短梭形为主，细胞突起短而粗、沿着细胞长轴的两端突起，且只有初级突起，呈树枝状向四周发出。髓核细胞从分类上其实是一种类软骨细胞[12]，若持续传代则出现纤维样变，与原代细胞形态差别较大。有研究观察到髓核细胞经体外培养并多次传代后，髓核细胞将经历显著的形态学变化[13]。本实验用原代退变髓核细胞进行生物力学拉伸以避免多次传代造成的细胞生物学性状改变。通过对四组对照的结果，发现B组细胞形态向正常髓核细胞发展，C组细胞形态接近于正常髓核细胞，D组细胞形态接近凋亡。通过表4可得各组细胞数量：10%拉伸幅度组>5%拉伸幅度组>对照组>15%拉伸幅度组，细胞拉伸后形态学及细胞数量的改变说明较小的拉伸幅度不足以促进退变髓核细胞的修复，而过大的拉伸幅度不利于退变髓核细胞的修复，故10%拉伸幅度最有利于退变髓核细胞的生长。

治疗椎间盘疾病一种可行的方法是在其早期进行动态牵引，这可以增加椎间盘的高度、改善椎间盘代谢，使椎间盘水分和营养物质增加，动态牵引装置可能在椎间盘疾病的治疗中扮演越来越重要的角色[14]。牵引的作用机制为：（1）使腰背部肌肉痉挛缓解，纠正脊柱侧凸；（2）使椎间隙增宽，突出物部分回纳，减轻对神经根的机械刺激；（3）上下关节突关节间隙增宽，使关节滑膜的挤压减轻，疼痛缓解或消失；（4）使粘连的神经根松解，改善神经根血运并促使周围的炎性介质减少，从而改善神经的感觉和运动功能[15-20]。根据临床牵引实验结果，牵引30 min时三组椎间隙高度和牵引前后椎间隙增加幅度均存在统计学差异，且20%体重组牵引30 min时各椎间隙增加幅度为5%左右、30%体重组牵引30 min时各椎间隙增加幅度为10左右%、35%体重组牵引30 min时各椎间隙增加幅度为15%左右。

本实验对退变椎间盘髓核细胞进行力学拉伸，以力求模拟牵引治疗腰椎间盘突出症，当牵引力为体重的30%时，椎间隙增高幅度为10%左右，在髓核细胞的拉伸实验中10%拉伸幅度最有利于退变髓核细胞的生长，故可以间接推断出当牵引力为体重的30%时，有利于退变髓核细胞的修复，说明30%体重牵引力适合于腰椎间盘突出症患者的牵引治疗。

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