典型污染物对藻类生态毒性效应研究进展

郐安琪，赵伟华，李青云，李 欢

(长江科学院 a.流域水环境研究所;b.流域水资源与生态环境科学湖北省重点实验室，武汉 430010)

当重金属、有机化合物及人工纳米材料等污染物进入水体后，通过参与水体的生物化学循环，影响着水生态环境安全，给人类生存带来极大威胁，制约着经济社会的可持续发展。在研究水生态环境毒理问题时，通常通过利用水生生物对水体有毒污染物的生理生态学效应来判定水体的污染程度。具体研究内容包括生态系统中有毒有害因素对动物、植物及微生物，在分子、细胞、器官、个体、种群及群落等不同生命层次的损害作用，及这些因素对生态系统影响规律等［1］。在水生生物毒理学研究中，藻类因具有个体小、繁殖快，能在较短的时间内得到受试物对其世代及种群水平的影响并可直接观察细胞水平上的中毒状况等特点［2］，在水体安全评价、环境毒物监测等方面越来越多的使用藻类作为实验材料。一般情况下，当藻类受到污染物毒害时，会表现出一定的胁迫反应，因此藻类常被用来作为环境毒理学的指示生物。藻类生态毒性效应的研究，可以为污染物的监测治理和排放标准的制定提供理论依据，同时为水体污染的生物评价提供一定的指导。

1 重金属的藻类生态毒性效应

1.1 单一重金属

藻类的生长不仅需要常量元素，如C，H，O，N，P，S，K，Ga，Mg 等，还需要 Cu，Fe，Mn，Cd 等微量元素，然而过量微量元素也会对藻类的生长产生一定的毒害作用，特别是一些重金属元素。研究结果表明，低浓度的重金属促进藻类的生长，高浓度的重金属对藻类的生长有抑制作用，该现象被认为是自我平衡(Homeostasis)效应［3］。Mallick 等［4］通过实验研究了3种重金属离子对栅藻(Scenedesmus)的毒性强弱，得出结论:Cu2+＞Cd2+＞Zn2+。一般情况下，重金属对藻类的毒性强弱依次为:Hg＞Cd＞≈Cu＞Zn＞Pb＞Co＞Cr。但这不是绝对的，不同的藻类对金属离子的毒性反应顺序可能有变化。本部分总结了不同重金属对不同藻类的毒性效应浓度，以及重金属对藻类光合作用、酶活性、代谢及细胞结构等方面的影响。

1.1.1 重金属对藻类的效应浓度

目前大多通过藻类生长抑制实验，测定半效应浓度(EC50)来确定重金属对藻类的毒性大小。从收集总结的文献内容来看，蓝藻门、绿藻门、硅藻门、金藻门、甲藻门等均有研究，其中以绿藻门为受试物种的研究最多;重金属主要包括 Cu，Cr，Cd，Zn，Pb，Mn等。通过现有研究发现，对于研究较多的重金属Cu，硅藻门的三角褐指藻较为敏感，其96h-EC50为0.017 mg/L，而蓝藻门的席藻耐受性较强，其96h-EC50为339 mg/L;对于重金属Cd，蓝藻门的水华鱼腥藻较为敏感，其96h-EC50为0.013 5 mg/L，甲藻门的米氏凯伦藻耐受性较强，其96h-EC50为13.134 mg/L。各类不同藻类受单一重金属胁迫的EC50进行归纳总结如表1。

1.1.2 重金属对藻类光合作用的影响

不同的藻类在重金属胁迫下，会产生不同重金属积累模式，从而对光合色素的生物合成产生不同程度的影响［30］。植物体内的重金属积累，将会与光合作用机制产生相互影响，产生如光氧化伤害等一系列毒性效应。特别是重金属改变了叶绿体膜功能和影响了光电子传递链(ETC)的组件形成，从而影响了光合作用的光反应阶段［31］。有实验显示，高浓度Cu2+(20～100 μmol/L)处理斜生栅藻，其光合作用受到抑制，阻碍了PSⅡ的电子传递、抑制了光合效率和光能利用效率，而低浓度的Cu2+处理其变化不显著［32］。然而，有些重金属对光合作用的影响是通过影响膜的通透性及干扰离子分布和抑制酶的活性来实现［33］，过量的Cu2+不利于叶绿素的形成与稳定，会与叶绿素形成配位化合物，从而降低叶绿素的含量［34］。杨丹慧等［35］的研究结果表明重金属离子引起叶绿素酶活性升高，使叶绿素降解加快，此外重金属Cu，Hg，Cd，Ni，Zn等可以替代叶绿素的中心镁原子，从而导致光合作用的破坏。

表1 不同重金属对藻类的半效应浓度Table 1 EC50of different heavy metals on alga

1.1.3 重金属对藻类酶活性的影响

重金属影响酶活性的机理一般有2种:一种是由于重金属的作用使作为酶的辅助因子的金属离子的吸收和利用受到阻碍;另外一种是重金属与酶蛋白的结合形成了螯合物，导致酶的结构和构型变化而影响了酶的活性［36］。实验表明低浓度的Cd2+促进了铜绿微囊藻过氧化物酶(POD)活性，而高浓度的Cd2+对其有较强的毒害作用，藻细胞受到破坏，蛋白质合成减少，使其抗氧化酶系统的活性降低。铜绿微囊藻和斜生栅藻细胞内的过氧化氢酶(CAT)活性随着Cd2+浓度的增加呈先上升后下降的趋势，均在Cd2+浓度为0.15 mg/L时活性达到最大，且与同期对照组相比差值极显著［35］。林碧琴等［37］在研究羊角月牙藻对Cd2+毒性的反应中得出:在非致死浓度(0.25～1.5 mg/L CdCl2)范围内随Cd浓度增加其DNA酶、脱氢酶和POD活性受到强烈的影响，细胞分裂、光合放氧速率和细胞膜通透性受到强烈抑制。

1.1.4 重金属对藻类细胞结构和代谢的影响

管越强等发现高质量浓度Cu2+抑制藻类的生长和繁殖，究其原因可能是影响了细胞原生质膜的渗透性，使钾从细胞内丧失［38］;邹思民［39］认为会使正常的藻细胞内部各种化合物的代谢过程不同程度受到影响，甚至造成某些代谢过程的中断;并且，Cu产生毒性后，会对藻细胞的结构造成破坏:小球藻和栅藻处于高浓度Cu2+条件下时，细胞畸变成内含物颗粒粗大的细胞，当转移到无Cu2+培养基中时，大细胞分裂，恢复到正常形态［40］。Cu2+还能使小球藻和纤维藻形成巨细胞，使组囊藻形成球形个体，与正常的形态完全两样［41］。藻在Cu2+中毒后，扁藻的叶绿体、线粒体、细胞核等的超微结构均受到不同程度的破坏，蛋白核解体呈碎块状［42］。有实验表明，Cd2+可导致小型月牙藻细胞外层呈脱落状，叶绿体体积相对缩小，结构改变，出现一个大液泡，细胞内含物颗粒增粗［43］。Ni2+使纤维藻产生毒性后，细胞壁加厚变形，细胞质出现明显的质壁分离，类囊体片层结构被明显破坏［44］。

1.2 多种重金属

在自然水体中通常是多种重金属元素共存。藻类常常受到多种重金属的联合作用而影响其正常的生长和繁殖，最终可能影响到它们的生理生化功能。重金属之间的联合作用的效应可分为拮抗、协同、相加、致敏4种情况［45］。刘益浩研究表明，当 Cu2+，Zn2+，Pb2+，Mn2+4种金属离子两两联合时，它们联合后的毒性作用效果各不相同，具体表现为协同或者拮抗。对于2种金属，搭配方式不同会导致作用效果的不同;即便是同一种搭配方式，随着时间的推移，作用效果也可能发生变化［24］。Davi Prasad用Cd2+和Pd2+分别与Ni2+组合处理纤维藻，结果发现Ni2++Cd2+，Cd2++Pd2+混合使用时比单独使用更刺激藻生长的拮抗作用［46］。Rai等在研究了Cr与Ni和Pd间相互作用对灰色念珠藻的影响时，表明Cr2++Ni2+，Cr2++Pb2+对该藻的生长的联合作用为拮抗，但Cr2++Ni2+的拮抗作用仅维持培养到72 h，随后表现为协同作用;Ni2+和Pb2+混合作用的影响与它们单独的影响差别不大［47］。

2 有机化合物的藻类生态毒性效应

近年来由于有机化合物的广泛应用和不当处理引起的环境污染问题也引起了社会的广泛关注。藻类作为水生生态系统的初级生产者，有机化合物对其影响也是不可忽视的。本部分从有机化合物对藻类的毒性效应浓度、光合作用、酶活性及藻细胞结构和叶绿素含量等方面进行了总结。

2.1 有机化合物对藻类的效应浓度

当前有机化合物污染十分普遍，如苯酚类化合物、农药、增塑剂、表面活性剂等都有研究。从目前的研究结果来看，增塑剂邻苯二甲酯(DBP)对斜生栅藻毒害性较强，其96h-EC50为0.021 mg/L，斜生栅藻对苯酚的耐受能力较强，其96h-EC50为341 mg/L。农药嗪草酮对小球藻的毒害性较强，其96h-EC50为0.021 mg/L，小球藻对高效氯氟氰菊酯的耐受性较强，其96h-EC50为105.71mg/L(详见表2)。

2.2 有机化合物对藻类光合作用的影响

朱术超等［60］研究表明乳糖酸红霉素(ETM)、双氯芬酸钠(DCF)及壬基酚十氧乙烯醚(NPEO10)等3种药物及个人护肤品(PPCPs)对斜生栅藻的生长及光系统Ⅱ(PSⅡ)均有抑制作用，特别是ETM的影响最大;对叶绿素荧光快速反应曲线的分析显示，ETM同时抑制斜生栅藻PSⅡ反应中心的供体侧和受体侧，使PSⅡ反应中心失活并降低光化学反应效率等，而DCF和NPEO10主要抑制电子传递链Qa后的电子传递过程。杨弯弯等［59］研究了恩诺沙星、硫氰酸红霉素暴露对铜绿微囊藻生长和生理的影响，结果表明这2种抗生素对铜绿微囊藻的生长有抑制作用，阻碍了铜绿微囊藻的光合作用，抑制了可溶性蛋白的合成。

2.3 有机化合物对藻类酶活性的影响

申琼等研究表明表面活性剂对斜生栅藻的密度及过氧化物酶的活性影响主要是由于季铵盐吸附在细胞的磷脂双分子膜结构表面，引起膜结构的破坏和功能的丧失，进而破坏叶绿素与酶结构，从而影响藻细胞光合作用及酶活性，最终导致细胞死亡［53］。何桢等通过研究三氯氰胺对斜生栅藻的毒性得出，当三氯氰胺的浓度为200 mg/L时酶的活性达到峰值，然后开始下降，在750 mg/L SOD的活性与对照相比减少了43.6%，三氯氰胺对斜生栅藻的脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的影响和对可溶性糖的影响效应是一致的，随着浓度的增加均在减少［61］。

表2 不同有机化合物对藻类的半效应浓度Table 2 EC50of different organic compounds on algae

2.4 有机化合物对藻细胞结构和叶绿素含量等的影响

况琪军等在研究增塑剂邻苯二甲酸二丁酯(DBP)致毒效应时得出该有机化合物降低了叶绿素a的含量，破坏细胞内含物，阻止藻细胞分裂等;对天然藻类则主要影响其细胞数量和种类数［62］。聂湘平等通过实验得出，随着多氯联苯(PCBs)质量浓度加大，蛋白核小球藻与斜生栅藻的细胞总数量呈逐渐下降趋势，藻类生长受到抑制，在低浓度(＜0.4 ng/mL)时表现为轻微的刺激生长作用，高浓度时(＞10 ng/mL)藻细胞增长缓慢，甚至为负增长，外观上藻液变黄或无色，显微镜下观察，叶绿体解体，细胞结构也不完整，破碎细胞残体比率较高，至50 ng/mL时完全停止生长［49］。段炼通过实验得出，离子液体1－丁基－3－甲基咪唑氯(［BMMIM］Cl)随着浓度的增大，其对斜生栅藻的生长抑制作用增强，导致叶绿素含量下降;暴露于80 mg/L［BMMIM］Cl溶液中，斜生栅藻细胞的超微结构受到影响，造成细胞质壁分离，叶绿体片层断裂，线粒体嵴数量减少［63］。

3 人工纳米材料的藻类生态毒性效应

随着纳米科技的发展，纳米材料逐渐走入人们的生活，并且越来越多地进入了环境当中。由于纳米材料的特殊理化性质，它对生态环境和人类健康具有潜在威胁［64－65］。对人工纳米材料环境效应和生物安全性的研究，主要集中于纳米氧化物、碳纳米材料以及纳米金属，因为这些纳米材料应用范围广而且具有高环境暴露风险。纳米材料对藻类的生长状况、细胞结构、光合色素含量、蛋白质含量以及酶类活性等产生一定的影响，其毒性效应还与纳米材料的特性、形态、尺寸、溶解度等相关［66］。由于纳米材料是新型材料，对其致毒机理的研究还不够深入，多集中在毒性效应研究方面，现按材料种类进行分析总结(详见表3)。

3.1 纳米氧化物

纳米氧化物对藻类的生态毒性效应研究是当前研究相对比较多的一种纳米材料，主要有纳米二氧化钛(TiO2)、纳米氧化镍(NiO)、纳米氧化锌(ZnO)、纳米氧化铝(Al2O3)等。

表3 人工纳米材料对藻类的毒性效应Table 3 Toxicological effect of nanomaterials on alga

目前纳米TiO2对藻类的效应研究很多。成婕等通过纳米TiO2对斜生栅藻的暴露实验得出，纳米TiO2在低浓度(＜5 mg/L)时可促进斜生栅藻的生长及叶绿素a的合成，但在高浓度(＞10 mg/L)下具有抑制作用［73］。李锋民等在研究纳米TiO2对短裸甲藻的抑制特性及酶活性、氧自由基等生理指标影响时发现纳米TiO2对短裸甲藻的生长有抑制作用，72h-EC50为9.7 mg/L;纳米TiO2对抗氧化系统和自由基的影响可能与其抑藻机制有关［69］。纳米TiO2包被的中空玻璃球可以抑制蓝藻和硅藻的光合作用，显示纳米材料在抑制海藻过度生长方面的应用潜力［74］。

纳米ZnO在低浓度时(5 mg/L)对斜生栅藻生长有显著促进作用，随着浓度升高，逐渐表现为抑制;在最高浓度(50 mg/L)时，细胞色素含量减少，蛋白质含量及抗氧化酶活性明显下降，引起显著细胞氧化损伤［70］。纳米Al2O3在纳米氧化物中的毒性相对较少，但也不是无毒害性，朱小山等研究表明纳米Al2O3(80 nm，α相)对斜生栅藻的96h-EC50大于 1000 mg/L［75］。巩宁等［76］通过研究两种粒径NiO纳米颗粒对小球藻的生物毒性，发现纳米颗粒的毒性与尺寸有关，7 nm NiO的毒性大于20 nm NiO 毒性，二者的 72h-EC50分别为18.01和74.64 mg/L。

在纳米金属氧化物中，纳米氧化锌和纳米氧化钛的毒性较强，而纳米氧化镍的毒性次之，受试藻种一般以斜生栅藻和小球藻为主，研究表明大部分材料对藻类的生长具有抑制作用，使藻细胞中的光合色素和蛋白质的合成受阻，破坏了抗氧化酶活性，对藻的生长和生理产生了很大影响。

3.2 纳米金属

纳米金属性质较为活泼，进入环境后可能发生变化，并以不同的形式作用于藻类。目前纳米Fe粉和Cu粉都是目前市场和生产应用较多的纳米金属，其对环境的影响也有了一些研究。居荫诚等人采用发光菌毒性检测技术对Cu、Al、Zn、Ti 4种纳米金属添加剂的生物毒性进行了检测与评价，结果表明纳米金属具有一定的生物毒性，且随着加入的比例增加而增加，其中Zn和Cu的生物毒性较大，当众多金属添加剂混合使用时，由于金属的协同作用，生物毒性明显增强［77］。傅凤等人在研究纳米Cu粉对斜生栅藻、椭圆小球藻、四列藻的生长影响时，得出2种粒径不同的纳米Cu粉对微藻的生长存在不同程度的抑制效应，纳米Cu粉比相同含量甚至十倍百倍于其含量的普通Cu粉对几种微藻的抑制效应要大得多［78］。Park等研究了纳米 Ag(20～50 nm)对蓝藻、铜绿微囊藻的生长抑制作用，表明1 mg/L的纳米Ag粒子显著抑制铜绿微囊藻的生长，抑制率为87%［79］。在纳米金属中，由于Fe元素是合成叶绿素的重要因子，所以纳米Fe对藻类的影响作用不显著，适量的Fe有助于藻类的生长。一般情况下，纳米颗粒的粒径越细微，其毒性越大，因此小粒径的纳米Fe的毒性不太明显。

3.3 碳纳米材料

以富勒烯、金属富勒烯和碳纳米管为代表的碳纳米材料在人类生产和生活中正显示出越来越多的不可替代的重要作用，与此同时也带来了一定的生态影响。牟凤伟等研究了不同类型的碳纳米管对斜生栅藻的毒性效应，结果表明碳纳米管对斜生栅藻的生长有抑制作用;对其毒害作用的大小首先与石墨烯片层的数目有关，单层的毒性大于双层的毒性;其次与碳纳米管的径向长度有关，具有相同石墨烯片层的碳纳米管中，较长的毒性大于较短的毒性［80］。龙志峰研究了3种不同管径的多壁纳米碳管(外径分别为9±2，28±6，70±9 nm)对蛋白核小球藻的毒性效应，结果表明3种纳米碳管在光照和黑暗条件下均能抑制小球藻生长，抑制作用随着浓度增加而增加，光照条件下的96h-EC50分别为41.0 ±3.0，12.7 ±0.2，12.4 ±0.7 mg/L。其毒性效应可以归因于对藻细胞的遮光效应、接触物理损伤和氧化损伤［81］。

4 藻类生态毒性效应研究展望

综上所述，典型的污染物会对藻类的生长、酶活性、光合作用、细胞结构和代谢等方面产生影响。关于污染物对藻类的生态毒性效应研究，可以从以下几个方面继续开展深入的研究工作:

(1)目前研究中表征藻类毒性效应的指标较多，包括藻类生长特征、叶绿素荧光特性以及酶类活性等各种指标，虽然各个研究者通过测试这些指标，得到了一定实验结果，但是这些方法指标比较杂乱不够系统，没有建立起一种公认的可以被广泛接受的检测系统和标准。因此建立科学、完善、标准的毒物测试系统是目前要解决的问题之一。

(2)在毒性实验方法上，当前大多数研究都只进行了急性毒性实验，而很少有研究者对藻类的毒性进行长期持续的观测，开展慢性毒性实验。虽然藻类有生长速度快、生长周期短等特点，但是在现有技术手段的支持下，是否可以找到其他途径和方法进行长时间序列的持续慢性毒性研究是将来可以探索的一个方向。

(3)现有污染物的研究都是单一的或者2种污染物(如2种重金属的联合毒性作用)对藻类的作用，但是实际的污染水域中污染物的种类繁多，往往都是多种污染物共同作用。例如纳米材料与水生态系统中已有污染物(重金属、持久性有机污染物等)是否有交互作用，以及这种作用大小的研究，对今后污染水体的研究具有重要的意义。

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