使用Lewis肺癌细胞建立昆明种小鼠肺癌模型初探

曹慧慧，张瑞卿，石荣伟，郭晓峰，李俊莲

（山西中医学院，山西太原 030024）

肺癌是当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，是全世界恶性肿瘤致死的首要因素［1］。肺癌临床表现复杂，难以早期发现，对其综合治疗的机会变小［2］。制备一种便于推广、成模速度快、成瘤率高的肺癌模型，有助于进一步了解肺癌的发病机理、转移过程，寻找早期肺癌诊断的特异性指标，更有针对性地筛选治疗肺癌的药物。至今已有不少国内外专家进行此项研究［3］，>其中裸鼠的移植成功率较高，但价格昂贵，且饲养条件苛刻，不便于推广。本实验拟采用昆明种小鼠皮下注射Lewis肺癌细胞建立肺癌模型，通过观察其一般状况、成瘤率以及成癌率，探讨昆明种小鼠皮下注射Lewis肺癌细胞能否建立一种理想的肺癌动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 昆明种小鼠32只，清洁级，雌雄各半，5～6w龄，体重18g～20g，中国医学科学院实验中心提供。

1.1.2 细胞 小鼠Lewis肺癌细胞株（LLC），购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.3 试剂与仪器 低速台式离心机（型号：80-2C），二氧化碳培养箱（型号：ENCO2），高压蒸汽灭菌器（型号：LMQ-R-3260B），DHG系列电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号：131019），胰蛋白酶-EDTA消化液（北京 Solarbio 公司，批号：20131118），DMEM/HIGH GLUCOSE（1X）（HyClone公司，批号：NYJ0960）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 小鼠Lewis肺癌细胞置于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素及100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，并培养于5%CO2，37℃饱和湿度的培养箱，每3～4d进行1次传代。传代时取对数期生长的细胞（80%confluence）经磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗1次，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加培养液中止消化并离心，弃上清液，加DMEM，吹打均匀，制成单细胞悬液，并将悬液均匀地分装在2个培养瓶中，使之铺满培养液瓶底面，并在放入培养箱时将培养瓶瓶盖拧开一圈半。

1.2.2 细胞收集 取处于对数期的细胞消化离心后弃上清液，加培养液并将数管细胞合入一离心管中，吹打均匀，制成单细胞悬液。

1.2.3 细胞计数与存活测试 取一滴细胞悬液与一滴台盼蓝混合均匀，用移液枪取少许置于细胞计数板上。存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中呈蓝色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入则不会呈蓝色。于低倍镜下计数对角的两个大方格内活细胞总数，计算细胞浓度。细胞数量须达到1×107/mL，方能给小鼠接种。

1.2.4 细胞悬液制备 收集的细胞离心后去上清液，定量加入DMEM，轻轻吹打均匀。

1.2.5 造模方法 32只雌雄各半的昆明种小鼠适应性饲养1w，雌雄各随机分为模型组与空白组2组，每组8只雌鼠、8只雄鼠。实验第1天用1mL注射器于模型组每只昆明种小鼠右下腋皮下接种0.2mL（活细胞浓度1×107/mL）细胞悬液，同时于空白组小鼠相同部位注射同等剂量的生理盐水。

1.2.6 观测指标

1.2.6.1 一般状况 每日观察小鼠的精神、活动、毛色、大便等情况，每天上午8时～9时记录每组小鼠24h进食量，并分别于第7、14、21、28天上午记录每只小鼠体重。

1.2.6.2 成瘤率 于第7、14、21、28天观察小鼠注射部位右腋皮下是否成瘤，按下列公式计算成瘤率。

1.2.6.3 成癌率 于第28天将小鼠摘眼球处死，将小鼠的肺组织与瘤体分离出来，保存在4%的甲醛中，并制成病理组织切片于显微镜下观察。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

精神、皮毛及活动情况：第1周被接种的模型组小鼠尚无明显改变。第2周模型组小鼠精神渐差，活动减少，皮毛尚可。第3周、第4周模型组小鼠精神不振，活动欠佳，皮毛暗淡无光泽，大便减少。同时，空白组小鼠在4w内精神活动正常，皮毛光泽。饮食及体重情况见表1、表2。

2.2 成瘤率

对成瘤小鼠进行瘤体分离，观察到瘤体周围血管丰富，并与周围皮肤粘连，无明显界限，不易分离。模型组小鼠第1周无瘤块生成，第2周有7只小鼠右腋下出现瘤块，第3周瘤块增大，成瘤小鼠增至11只，第4周瘤块增大，无新增成瘤小鼠。成瘤率为68.75%（11/16）。

2.3 肺癌形成率

将空白组与模型组小鼠的肺组织切片进行HE染色，并在光镜下观察。空白组小鼠肺部切片未见癌细胞。模型组小鼠中未成瘤小鼠未见癌组织，11只成瘤小鼠中均可见到癌细胞，模型组肺癌形成率为68.75%（11/16）。癌组织在光镜下观察：细胞核裂解，细胞体积变大，细胞形状不规则，排列紊乱。结果见图1。

图1 昆明种小鼠肺癌组织病理结果（HE染色）

3 讨论

实验采用Lewis肺癌细胞致昆明种小鼠形成肺癌，体外培养Lewis肺癌细胞，将其植于昆明种小鼠右腋皮下，观察其成癌率，结果昆明种小鼠腋下Lewis移植成瘤率为68.75%，肺癌形成率为68.75%。选择腋下，因为腋部皮下移植不影响小鼠活动，易于观察肿瘤的生长［4］；且腋下淋巴血管丰富，Lewis肺癌细胞易于转移。选择5～6w龄的小鼠，是因为研究发现在成年鼠体内生成的肿瘤有自行消退现象，而在年幼的小鼠体内接种肿瘤细胞会相对容易生成瘤块［5］。成功率不高的原因可能与下列因素有关：在制备细胞悬液过程中，没有注意轻柔吹打，减少细胞死亡量；给小鼠接种细胞时，没有保障接种的数量。

表1 注射后小鼠进食量 （g，±s）

表1 注射后小鼠进食量 （g，±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05

组别 第1周 第2周 第3周 第4周雌雄雌雄雌雄雌雄空白组 11.19±1.23 11.45±1.06 13.43±1.05 13.67±1.42 15.91±0.94 16.08±1.83 15.52±1.05 16.51±1.98模型组 10.99±1.25 11.06±1.07 12.03±1.521） 12.62±1.231） 11.73±1.391） 12.77±1.391） 10.89±1.241） 13.34±1.141）

表2 各组动物不同时间点的体重 （g，±s）

表2 各组动物不同时间点的体重 （g，±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05

组别 注射前注射后第1周 第2周 第3周 第4周雌雄雌雄雌雄雌雄雌雄空白组 18.57±0.85 18.75±0.68 21.10±2.06 22.10±2.07 22.93±2.28 23.81±2.04 25.25±2.06 27.31±1.96 28.34±1.96 30.07±2.60模型组 18.66±0.68 18.71±0.66 20.00±1.101） 20.04±1.441） 20.87±1.431） 21.03±1.331） 22.58±1.661） 23.10±1.531） 23.49±1.771） 24.04±1.721）

综上，使用昆明种小鼠注射Lewis肺癌细胞能够成功制备肺癌模型，昆明种小鼠易于获得、价格低，生存环境与人体相似，可作为肺癌实验动物进行使用。但实验周期长，成癌率有待提高，建模的具体操作仍需进一步完善。

［1］Bugiantella W，Cavazzoni E，Graziosi L，et al.Small bowel metastasis from lung cancer：a possible cause of acute abdomen.Case report and literature review［J］.G Chir，2011，32（3）：120-122.

［2］Benfield J R，Hammond W G.Bronchial and pulmonary carcinogenesis at focal sites in dogs and hamsters［J］.Cancer Res，1992，52（9）：2687-2693.

［3］余琛琳，崔淑芳.肺癌动物模型的制备与应用［J］.中国动物实验学报，2008，16（6）：470-474.

［4］田雪.建立移植型肺癌动物模型的最新方法和进展［J］.重庆医科大学学报，2007，32（12）：1337-1338.

［5］李春燕，王颖，刘浩，等.C57BL/6近交系小鼠Lewis肺癌动物模型：建设性描述肺癌损害程度的指标［J］.中国临床康复，2003，26（7）：3582-3583.