淫羊藿苷对兔椎间盘纤维环细胞生物学特性的影响

杜文喜，谢 健，夏臣杰，黄杰烽，陈俊杰，段淑芳

（1.浙江中医药大学附属第一医院，浙江杭州 310006； 2.浙江中医药大学，浙江杭州 310053；3.浙江中医药大学附属第二医院，浙江杭州 310005）

淫羊藿苷（Icariin，ICA）是淫羊藿属（Epimedium）植物淫羊藿茎叶中提取的总黄酮主要有效成分［1］。研究显示，淫羊藿苷持续用药对脊柱损伤（椎板摘除）的老鼠具有显著性治疗作用［2］。纤维环破裂、髓核膨出等引起的椎间盘退变是目前临床脊柱患者的主要病因，而ICA是否可以延缓椎间盘退变目前尚不明了。体外培养纤维环细胞至3～4代开始出现细胞形态改变、增殖减少、细胞外基质合成不足、细胞周期异常等退变现象［3-4］，有学者认为此时的细胞可用于模拟体内椎间盘退变模型［5］。本研究通过对椎间盘纤维环细胞体外模型持续干预，旨在评价ICA对退变期细胞的作用效果，为ICA应用于临床防治椎间盘退变疾病提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

新西兰雌性大白兔10只（清洁级，体质量2～3kg），浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 试剂与仪器

0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gbico）、Ⅱ型胶原酶、MTT、甲苯胺蓝染液（Solarbio）、DMEM、F12培养液、PBS（吉诺）、胎牛血清（FBS，四季青）、DMSO（Sigma）、淫羊藿苷（ICA，中国食品药品检定研究院，110737-200415）、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（碧云天）、Trizol（Invitrogen）；逆转录试剂盒（Promega）、培养箱（Thermo）、洁净工作台（Airtech）、倒置相差显微镜（Olympus）、台式离心机、电热恒温水浴锅（上海）、培养瓶、培养板（NEST）、酶标仪（Bio-tek）、流式细胞仪（Epics Altra）、RT-PCR 仪（Takara）等。

2 实验方法

2.1 纤维环细胞的分离培养

无菌条件下分离新西兰大白兔椎间盘纤维环组织，置于培养皿中。DMEM/F12（1∶1）混合液洗 2遍后剪成1mm3的小块，按0.1%胰蛋白酶-EDTA、0.1%Ⅱ型胶原酶37℃水浴顺序消化30min、4h。消化完毕后离心（1500rpm，5min），弃上清，加入含 15%FBS的DMEM/F12（1∶1）培养液制成细胞悬液。培养箱（37℃、5%CO2）培养，2～3d换液 1次。细胞铺满单层后胰酶消化法传第1代，细胞计数并将密度调整为105个/mL。

2.2 分组及传代培养

取一部分第1代细胞作为P0组铺板后待测；剩余细胞分为空白组（15%FBS培养液培养）与ICA组（含ICA的15%FBS培养液培养，ICA浓度10-5M），这部分细胞传至第3代铺板后待测。传代过程中细胞密度均调整至105个/mL。

2.3 指标检测

2.3.1 甲苯胺蓝染色 细胞接种48h后，贴壁细胞PBS洗2次，4%多聚甲醛4℃固定1h，蒸馏水清洗20min后2%甲苯胺蓝染液浸染2h，吸去多余染液后倒置相差显微镜下观察、拍照。

2.3.2 MTT法检测细胞增殖 将细胞接种于96孔板，12个复孔，每孔200μL细胞悬液。48h后向96孔板中加入20μL MTT溶液，细胞培养箱继续孵育4h。小心吸除上清后滴加DMSO溶液150μL，微量振荡器上震荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪490nm波长测定各孔吸光度值为m，吸净孔内溶液再测1次为n，实际吸光度（OD值）为（m-n）。

2.3.3 RT-PCR检测蛋白多糖（AGG）表达 细胞接种72h后，根据Invitrogen公司Trizol操作说明书提取椎间盘纤维环细胞总RNA。然后根据Promega公司M-MLV操作说明书将RNA逆转录获得cDNA，最后进行RT-PCR检测。扩增引物如表1，GAPDH为内参照基因。最后以相对CT值（目的基因CT值/内参基因CT值）表示结果。

表1 RT-PCR扩增引物序列

2.3.4 流式细胞仪检测细胞周期 细胞接种72h后按照细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒处理，然后流式细胞仪488nm波长检测红色荧光并进行分析。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 甲苯胺蓝染色

原代椎间盘纤维环细胞22h后开始贴壁，4d后完全贴壁，细胞呈类圆形见细小突触或呈梭形，12d后细胞贴满瓶底。甲苯胺蓝染色呈易染性，细胞核呈紫色，细胞质呈淡蓝色或深蓝色。如图1所示，镜下可见细胞分布均匀，空白组细胞分布最稀疏，而ICA组细胞分布密集程度接近于P0组。

图1 椎间盘纤维环细胞甲苯胺蓝染色

3.2 细胞增殖情况

经 MTT 法检测，P0组吸光度值为（0.68±0.064），空白组吸光度值为（0.55±0.037），ICA组吸光度值为（0.64±0.028），P0组与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；P0组与ICA组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。说明随着细胞传代，细胞活力逐渐下降、增殖能力减弱，而ICA能够维持椎间盘纤维环细胞增殖能力，使其接近于原代细胞。

3.3 AGG表达差异

经RT-PCR检测椎间盘纤维环细胞AGG表达相对CT值P0组、空白组及ICA组分别为（1.238±0.018），（1.196±0.007），（1.220±0.006）。与空白组比较，其余两组相对CT值均显著升高（P<0.05）；P0组与ICA组比较差异无统计学意义（P>0.05）。说明随着细胞传代，椎间盘纤维环细胞分泌AGG的能力逐渐减弱，而ICA持续用药可以使纤维环细胞的分泌能力基本与原代细胞一致。

3.4 细胞周期分布

细胞周期分布见图2。

图2 椎间盘纤维环细胞流式细胞仪测试图

箭头区域代表S期细胞，可见空白组S期细胞所占比例最少。椎间盘纤维环细胞S期细胞分布百分比P0组、空白组及ICA组分别为（8.591±0.124）%，（4.566±0.173）%，（7.187±0.699）%。与空白组比较，P0组及ICA组S期细胞分布百分比均明显增加（P<0.05）；P0组与ICA组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。说明ICA能够使纤维环细胞保持接近于原代细胞的细胞分裂能力，使其不至于过早凋亡。

4 讨论

纤维环是椎间盘的重要组成，水含量占60%～70%，胶原蛋白占干重的60%，蛋白多糖占干重的20%［6］。其中胶原蛋白与蛋白多糖是纤维环最主要的细胞外基质，是衡量纤维环细胞生物活性的重要指标。椎间盘纤维环中蛋白多糖含量的下降或成分的改变，均影响其中的胶原纤维稳定和纤维板层间的滑动，引起纤维环退变［7］。纤维环细胞为一种软骨细胞［3］，缺乏特异性标志物，目前仅局限于细胞表型、特异亲和力染料、多种抗原检测对该种细胞进行鉴定［8］。本实验纤维环细胞呈多角形或梭形，甲苯胺蓝染色具有易染性，与文献所述一致［9］。

通过微创手术损伤纤维环建立椎间盘退变模型［10］，操作复杂，实验周期较长。周江涛等［11］采用该种方法需8w后才能造模成功而进入细胞实验阶段。本实验采用持续培养法造成椎间盘纤维环细胞自然退变，空白组与P0组比较可见细胞增殖减慢、S期细胞比例减少、AGG分泌不足，基本符合退变纤维环细胞的生物学特性。而且，持续培养法简便易行，是纤维环细胞退变造模的良好选择。

ICA具有调节骨代谢和双向免疫调节作用。有研究证实，ICA对体外培养的软骨细胞具有维持表型、促增殖作用，并且促进细胞外基质成分胶原与蛋白多糖基因的表达而抑制其降解［12-13］。本实验通过对第1代椎间盘纤维环细胞持续ICA给药至第3代，结果显示ICA具有延缓纤维环细胞退变的作用，使该细胞生长增殖及细胞外基质分泌的能力基本接近于第1代细胞。细胞增殖及细胞周期检测，ICA组较P0组有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），可见ICA并不能完全控制或逆转细胞退变。

药物治疗对于临床尚未出现手术适应征的椎间盘退变患者不能忽视，ICA可以是临床医生的一种选择。但是ICA通过何种途径延缓退变？对于患者，其最佳干预时间及浓度是多少？这些都是ICA临床应用前需要解决的关键问题。

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