miR-10b在肾癌中的表达及临床意义研究

胡祎民 金露 李一帆 陈独群 苏郑明 刘家驹 杨尚琪 桂耀庭 毛向明 来永庆

微小 RNA（microRNA，miRNA）是非编码RNA的一种，长度在20～25个核苷酸左右［1］。因有研究发现miRNA能够通过抑制mRNA翻译或使mRNA降解调节基因表达，因此，miRNA近年来成为研究热点［2］。miRNA在多种重要的细胞生物进程中均发挥着重要作用，如细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡等［3］。在包括肾癌在内的多种肿瘤组织中均检测到miRNA的异常表达，基因芯片筛选出了在肾癌组织中表达异常的miRNA［4］。但是，和已经发现的在乳腺癌［5］、喉癌［6］及肝癌［7］等肿瘤组织中的高表达不同，miR-10b在肾癌组织中表达下调，因此我们选用miR-10b作为研究对象，验证其在肾癌组织中的表达水平，探究其在肾癌发生、发展中所发挥的作用。

肾细胞癌（renal cell cancer，RCC），简称肾癌，起源于近端肾小管，是肾脏肿瘤中最常见的类型［4］。肾癌最常见的组织类型为透明细胞癌，约占肾细胞癌的75%～80%［3］。约30%的患者诊断时已经存在远处转移，由于对放疗、化疗不敏感，目前肾癌的主要治疗方法只有通过外科手术切除［8］。美国2013年统计数据表明新发肾癌病例有65 150例，其中有8 780例因肾癌死亡［9］。肾癌发病早期无典型症状，预后不佳，因此寻找可用于肾癌早期诊断、靶向治疗及预后判断的生物标志物就尤为重要。

本研究通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测配对组织、肾癌细胞系中miR-10b的相对表达量，分析其表达水平与患者临床病理特征的相关性，探究miR-10b与肾癌发生、发展的关系。

材料与方法

一、标本收集及临床资料

收集35例肾癌及相应的癌旁组织，所取标本均经医院医学伦理委员会批准，患者均已签署知情同意书。标本均由手术切除，且切除后置于RNA保护液中，24h后转移至-80℃液氮中保存。每对标本包括肾癌组织（显微镜检证实癌细胞80%以上）1例、癌旁组织（手术切除距肾癌病灶5cm以上，显微镜检提示正常细胞90%以上）1例。所有病例均有完整的临床资料（见表1），组织分型参考 WHO分类标准，临床分期参考2009年美国癌症联合会的标准进行。

二、细胞系及细胞培养

人RCC细胞系：786-O、ACHN细胞（美国细胞培养收藏中心，美国）。人胚肾细胞系：HEK-293T（中国医学科学院培养物收藏中心，中国）。细胞接种于含1%谷氨酰胺、1%抗生素及10%胎牛血清的DMEM培养液，放置在37℃，5%CO2温箱中培养。

三、总RNA提取及逆转录

在液氮下碾磨标本组织、培养细胞，使用Trizol试剂（Invitrogen，USA）分别提取总 RNA，使用NanoDrop 2000／2000c测定RNA浓度。按照反转录试剂 miScript RT Kit（Qiagen，Germany）说明书所述，取1μg总RNA加入反应体系进行逆转录，反应在普通RT-PCR 仪（BIO-RAD，USA）上进行。反应程序：37℃60min，95℃5min。

四、qRT-PCR检测miR-10b水平

根据miRNA 荧光试剂 miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany）说明书所述，进行qRTPCR反应，反应在LC 480荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，USA）上进行。miR-10b正向引物由Qiagen公司合成：5′-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3′，反向引物为Qiagen公司试剂盒中提供的通用引物；以U6snRNA作为内参照进行标准化处理，U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-ACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′。反应条件：95℃15min，94℃15s，55℃30s，70℃30s，共计完成40个循环。

五、统计学方法

按 照 公 式 2-ΔCT（ΔCT ＝ CTmiR-196a-CTU6，ΔΔCT＝ΔCTRCC-ΔCTNormal）计算 miR-10b的相对表达量［10］，2-ΔΔCT即 miR-10b在肾癌及正常组织中表达量比值。采用配对t检验分析配对组织间、各细胞系之间miR-10b表达水平差异。将病例资料按年龄、性别、组织类型、临床分期分组（年龄以中位数51岁分界），按肾癌组织miR-10b相对表达量平均数分为高表达组、低表达组，列出四格表，行χ2检验探究miR-10b表达水平与患者临床特征之间的关系。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、miR-10b在肾癌组织、肾癌细胞系（786-O、ACHN）中表达下调

采用qRT-PCR检测组织及细胞系中miR-10b的表达水平，结果显示786-O、ACHN肾癌细胞中miR-10b表达水平均低于 HEK-293T（P＜0.05），结果如图1所示。在35例肾癌标本中，26例（74.29%）肾癌组织miR-10b表达水平下降，肾癌组织中miR-10b表达水平明显低于正常组织（P＜0.05），结果如图2A所示。通过2-ΔCT计算miR-10b在组织中相对表达量，在肾癌中其均数±标准误为0.273 84±0.054 63，结果如图2B所示。

二、miR-10b表达水平与病例临床特征的相关性

通过χ2检验探究miR-10b表达水平与患者临床特征之间的关系，结果如表1所示，未发现miR-10b表达水平与病例相关临床特征之间有相关性。

图1 miR-10b在细胞系中的相对表达量

图2 miR-10b在正常组织及肾癌组织中的表达

表1 miR-10b表达水平与患者临床病理特征之间的关系

讨 论

miRNA是一类内源性具有调控功能的非编码RNA，其在多种细胞生物进程中都扮演着重要的角色［11］。超过半数的miRNA位于染色体的脆性位点及与肿瘤发生相关的基因区域［12］，这也表明了miRNA在肿瘤发生中所扮演角色的重要性及复杂性。miRNA通过和mRNA的3′端不完全性结合，抑制信使RNA翻译或使其降解发挥基因调节作用［13］。据推算，超过60%的编码基因均受到miRNA的调控［14］。有研究证实，miRNA和肺癌、头颈部肿瘤等的预后相关，miRNA也有作为肿瘤标志物应用于临床的可能［15］。

miR-10b位于人类2号染色体［4］，有关研究发现在多种肿瘤中均有miR-10b的表达升高，且和肿瘤的发生机制相关，但尚无miR-10b在肾癌中的功能研究。在乳腺癌中miR-10b的表达是上调的，且通过抑制miR-10b的表达可以对抗转化生长因子（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）引 起的细胞侵袭、细胞增殖及上皮细胞-间充质细胞转换，从而可以抑制乳腺癌组织的生长及转移，因此在乳腺癌中 miR-10b是基因治疗的可能靶点［5］。miR-10b在鼻咽癌中表达上调，Allaya等［13］的研究发现miR-10b通过作用于LMP1及Twist1通路发挥其作用，且miR-10b的表达水平和鼻咽癌的临床分级及诊断时年龄相关，提示其作为生物标志物应用于鼻咽癌诊断的可能。Sun等［16］的研究发现miR-10b可以上调基质金属蛋白酶9（matrix metal-loprotein9，MMP-9）的表达水平，抑制miR-10b的表达则可以明显下调钙黏蛋白（epithelia cadherin，E-cadherin）的表达水平，从而在鼻咽癌细胞的迁移及侵袭中发挥重要作用。在肝细胞癌中同样检测到miR-10b的高表达，且miR-10b可以通过HOXD10／RhoC／uPAR／MMPs通路调节肝癌细胞的迁移和侵袭，因此miR-10b是肝细胞癌靶向治疗的靶点选择之一［7］。在许多肿瘤组织中miR-10b的表达均升高，而在肾癌中检测到miR-10b的表达下调，提示miR-10b在肾癌中的作用机制与在其他肿瘤组织中不同，对miR-10b进行研究可能会对肾癌的发生及发展机制有所了解，也为肾癌的基因靶向治疗提供一个新的选择。

本研究在肾癌组织及肾癌细胞中验证了miR-10b的表达水平，结果证实miR-10b在肾癌组织中表达水平相对配对癌旁正常组织明显下降，且在肾癌细胞系（786-O、ACHN）中表达水平明显低于HEK-293T。未发现miR-10b的异常表达和患者年龄、性别、肾癌组织类型及分期相关，但这不能排除因样本数过少产生的偏倚，需要扩大样本量进一步验证。

目前关于miRNA功能研究的方法已较成熟。下一步的实验将收集更多组织标本验证其表达水平及miR-10b和患者临床病理特征之间的关系，进而将miR-10b功能类似物及抑制物分别转染到细胞中，通过观察细胞增殖、迁移、凋亡等一系列生物进程探究miR-10b对肾癌细胞的功能调节，最后通过荧光素酶、蛋白质印迹等实验寻找miR-10b在肾癌细胞中的靶基因。

总之，肾癌组织及细胞中miR-10b的表达水平下调，提示其对于肾癌的发生及发展机制研究有一定意义，为肾癌靶向治疗提供了一个新的选择。但目前尚无miR-10b在肾癌中的功能研究报道，本研究为后续miR-10b的功能及作用机制研究奠定了基础。

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