绿色木霉菌种制备工艺优化与工业化制备考察

李宝成，满丽萍，果 然，李延锋，冯卓彦

（1.湖北中化东方肥料有限公司，武汉430213，2.中化化肥有限公司，北京100031）

目前以农业可持续发展为宗旨的植物病虫害生物防治，在农业生产中起着越来越重要的作用。绿色木霉菌(Trichoderma viride)是一类具有重要经济意义的生防有益菌，对多种引发土传病害的病原菌具有抑制作用，其作用机制已得到广泛深入的研究和报道，但是对其规模化生产的应用技术相关报道较少。目前生产的木霉菌剂多为分生孢子制剂，通常采用固体发酵或液、固两相发酵生产，孢子产量被作为衡量发酵优劣的核心指标。固态发酵是获得大量真菌孢子的最好方法，通过固态发酵产生的孢子质量较高。孢子在干燥或紫外照射等环境下的抵抗性更强，贮存后孢子的存活率较高，并且发酵产品干燥后可直接制备成菌剂，工艺流程短，工艺环节少，生产成本更低，产品质量更可靠[1]。在实际生产过程中绿色木霉生产比较繁琐，特别是在液、固两相发酵的生产过程中，通常是通过2%～3%液体种子或大量的克氏瓶斜面种子接种液体发酵罐后，接种固体培养基进行固体发酵生产绿色木霉制剂。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

供试菌株：经华中农业大学生命科学院鉴定为绿色木霉 （Trichoderma viride）。PDA培养基[2](g/L)：200g马铃薯、20g葡萄糖、23g琼脂。121℃灭菌30min，备用。液体培养基 （g/L）：湖北中化东方肥料有限公司。固体培养基 （g/L）：湖北中化东方肥料有限公司。

1.2 实验仪器

DT2000A型电子天平 （江苏省常熟市意欧仪器仪表有限公司）；高压灭菌锅 （上海申安医疗器械厂，LDZX-50KBS型）；单人净化工作台 （北京利康达科技发展有限公司，SW-CJ-1D型）；恒温培养箱 （上海索谱仪器有限公司，PCE-3000型）；显微镜 （重庆市奥普光学仪器有限公司，UB100i）；

恒温振荡器 （国华电器有限公司，BS-4G）；离心机（上海安亭科学仪器厂，TDL-40D）；

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化

将PDA培养基均匀分装在试管中，于121℃灭菌30min，冷却至室温，摆置成斜面，在超净工作台上无菌操作接4℃保藏的绿色木霉菌种，29℃培养，培养时间为7天。

1.3.2 液体种子培养

使用250ml量筒将200ml液体培养基分装入500ml三角瓶中，于121℃灭菌30min，冷却至室温后接入活化菌种，置于恒温振荡器中29℃180r/min下培养。

1.3.3 孢子制备

将PDA培养基分装约70ml/250ml克氏瓶中，于121℃灭菌30min，冷却至室温，在超净工作台上无菌操作接种后，置于29℃恒温培养箱静置培养7天，用刮下斜面孢子使用无菌水制成孢子悬液，经实验室血球计数检测结果为：平均每个克氏瓶的孢子总数约为150亿个。

大强度运动时相当于最大吸氧量的70%-80%（即70%-80%VO2max），运动时的心率约为125-165次/min，中等强度运动相当于最大吸氧量的50%-60%，运动时的心率约为110-135次/min，小强度运动相当于最大吸氧量的40%以下，运动时的心率约为100-110次/min。在实践中，大学生应根据自己的身体状况及亚健康程度来选择适宜的运动强度，一般可选择中等强度运动。

1.3.4 根据正交表设计的4种固体培养基

麸皮、海藻活性粉、玉米粉、稻壳组分称量并搅拌均匀，定量装入500ml三角瓶中，于121℃灭菌1h，按10%的接种量接入摇床培养24h的液体种子，置于恒温培养箱中29℃静置培养，每日翻动一次三角瓶，发酵5天后取出，干燥后测定孢子数量。

1.3.5 三角瓶摇床实验验证，液体培养基200ml经250ml量筒分装500ml三角瓶中，于121℃ 灭菌30min，根据各处理的接种量接种发酵。处理1（对照）液体种子接种量0.015%；处理2正常液体接种量2%；处理3正常固体克氏瓶斜面种子12个；处理4固体孢子接种量0.015%。

于29℃180r/min摇床上培养。离心机4000r/min，5min离心去上清液，万分之一天平精确称量，按不同发酵周期检测单位体积的菌丝体湿重。

1.3.6 车间液体发酵罐发酵验证，数据详见2.3.3表4。

2 结果和分析

2.1 固体培养基配方选择

提培养基以麸皮为氮源发酵培养基的最佳有机氮源，玉米粉与麸皮的水平比例为1:1[3-6]，另外添加硫酸镁、碳酸钙0.8%，pH值自然。本实验以原有固体培养基配方为基础，通过正交设计优化固体培养基组分麸皮、玉米粉、细稻壳、玉米浆的含量，选择最佳含量。

表1 因素水平 %

通过正交设计实验设计结果如表2。

试验目的找出试验结果因素影响的主次顺序，从表2的极差R的大小顺序排除的因素的主次顺序为：

最优化培养基组分为：A3B2C1D3和A3B3C1D3，根据原料成本优先选择A3B2C1D3作为生产配方。

表2 正交设计L9（34）

2.2 正交实验数据结果方差分析

方差来源F=SS fjf A 9.76 2 4.88 20.77 显著B 0.88 2 0.44 1.87 不显著C 25.15 2 12.58 53.51 显著D 0.47 2 0.24 1 不显著

查表F0.05(2，2)=19.00F0.01(2，2)=99.00，故因素C、A作用显著，因素B、D作用不显著，与前面极差分析结果一致。

表3 同发酵周期取样菌丝体含量检测结果

2.3 实验验证

2.3.1 摇瓶实验，通过200ml/500ml三角瓶摇瓶培养后同发酵周期取样菌丝体含量检测结果，见表3。

2.3.2 三角瓶摇瓶小试实验，根据不同发酵周期检测菌丝体湿重 （g/40ml），见图1。

图1 不同发酵周期

2.3.3 优化菌种工艺通过100L发酵罐发酵验证，与原工艺发酵周期菌丝体含量检测对比结果，见表4。

表4 与原工艺发酵周期菌丝体含量检测对比

3 结论

实验通过正交实验固体发酵制种提高单位物质的孢子数量，优化后的固体培养基组分为：小米35%，玉米粉25%，玉米浆10%，麸皮30%，分生孢子的最大产量可达到7.7x109个/g（干培养物）。且该实验优化后的工艺缩短了菌种员在生产菌种制备、菌种纯度验证时间和工作量，制种、验证和接种时间由原来的2h减少至25min，并且有效控制了生产菌种的生长同步性，使得种子罐发酵时绿色木霉孢子的萌发时间统一、菌丝体对数生长期基本一致，同时尽可能的降低染菌几率。通过液体摇瓶验证菌丝体含量明显提升，特别是车间100L的液体发酵罐中试生产应用数据表明，将接种量由原来的液体菌种2%或克氏瓶斜面种子12个，改进为现在固体菌种接种量为0.015%后，液体发酵在发酵周期30h时的菌丝体含量较原工艺同时期的菌丝体含量提升了1.25倍。该优化后的工艺可大幅度提高绿色木霉菌工业化生产的效率。

[1]夏斯琴,王伟.绿色木霉T4的固体发酵工艺及其制剂稳定性的研究.化学与生物工程,2008,25(12):52～56

[2]董义伟,李大平,等.纤维素酶的固态发酵及酶学性质的研究.天然产物研究与开发,2007,19:393～395,409

[3]林元山,张曙光,梁智群.绿色木霉固态发酵稻草秸秆产纤维素酶的研究.湖南农业科学2007,(3):46～48

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[5]张良,纪明山,张玉芬,等.绿色木霉TR-8发酵工艺条件筛选.沈阳农业大学学报,2005,36(4):494～496

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