哈尔滨地区老年性耳聋与GRHL2基因SNP位点的相关性

周彬 徐平 崔忠涛 冯淼 柏智刚 马肖男 李婷婷

哈尔滨医科大学附属第四医院耳鼻咽喉-头颈外科（哈尔滨150001）

哈尔滨地区老年性耳聋与GRHL2基因SNP位点的相关性

周彬 徐平 崔忠涛 冯淼 柏智刚 马肖男 李婷婷

哈尔滨医科大学附属第四医院耳鼻咽喉-头颈外科（哈尔滨150001）

目的研究哈尔滨地区汉族人群老年性耳聋与GRHL2基因SNP位点的相关性，探讨GRHL2基因与老年性耳聋的遗传易感性的可能关系方法选择哈尔滨市区或郊县50岁以上449位中老年人作为研究对象，听力下降至少25分贝以上的224例为病例（老年性耳聋）组，听力下降小于25分贝的225例作为正常组。采用Sequenom MassARRAY特定SNP基因分析检测的方法，计数rs10955255，rs2127034，rs1981361多态位点的各组基因型频数和等位基因频数，应用卡方检验进行统计分析判断各组间差异。结果rs10955255与rs2127034多态位点病例组与对照组比较，基因型及等位基因分布差别均无统计学意义(P>0.05)；rs1981361多态位点病例组与对照组比较，基因型及等位基因分布差别具有统计学意义(P<0.05)。结论哈尔滨地区汉族老年性耳聋与GRHL2基因rs1981361SNP位点具有相关性，GRHL2基因可能是研究老年性耳聋遗传易感性的一个有意义的基因，本结果为进一步进行大规模多中心的相关方面研究提供了基础。

老年性耳聋；GRHL2；单核苷酸多态性

随着社会人口的老龄化,老年性聋已成为人类常见的听力疾病。老年性聋也称作年龄相关性聋,主要是指随着年龄的增加逐渐发生的以高频听力下降为主的感音神经性听力损失。老年性聋是环境因素及遗传因素共同作用的结果[1-2]；有研究表明遗传因素在老年性聋发生发展过程中所起作用的比例约为35%-55%[3，4]。

Van Laer L等[4]学者利用候选基因关联分析的方法对GRHL2基因与老年性聋的关系进行研究,结果显示GRHL2基因的许多个SNPs，尤其是rs10955255, rs2127034和rs1981361的多态位点与欧洲人老年性聋遗传易感性相关联，因此，进一步探讨GRHL2是否为真正的老年性聋遗传易感基因具有重要的研究意义。

本研究以中国哈尔滨地区汉族人群为遗传背景，将GRHL2基因的rs10955255,rs2127034和rs1981361 SNP作为目标位点，以探讨GRHL2基因在老年性耳聋遗传易感性方面的可能意义。

1　资料与方法

1.1一般资料

从1268名自愿者中随机选取449例汉族中老年人，来自哈尔滨市区或郊区，年龄在50岁以上,均没有吸烟及饮酒史,生活规律。病例组：224人，听力下降至少25dBHL以上，正常组：225人，听力下降小于25dBHL。两组研究对象均排除传导性聋（优侧耳在0.5、1.0、2.0kHz的平均气骨导差超过10dBHL)、噪声性聋(有明确的噪声接触史，且优势耳在4.0kHz下降，4.0kHz比8.0kHz阈值高20dB以上)、以及其他疾病导致的耳聋：包括药物性聋、突发性耳聋、梅尼埃病、耳硬化症、中耳粘连、听神经瘤及自身免疫性感音神经性聋等,所有研究对象均无耳聋家族史。

本研究经哈尔滨医科大学附属第四医院伦理委员会论证同意，449例研究对象均签署知情同意书，自愿参与本项研究。

1.2听力检查

听力学检查应用GSI61双通道诊断型听力计对所选志愿者进行纯音测听检查，初步判断听力损失程度；应用GSITympstar声导抗检测仪进行鼓室压力、声顺值、声反射及镫骨肌反射检测，了解中耳传导状况；应用GSIAudera脑干诱发电位测试系统进行听性脑干反应检测，确定听觉阈值及排除听神经相关病变。以上测试设备均产自美国格雷森-斯塔德勒公司。

1.3耳聋表型的分析判断标准

本研究的耳聋表型判断标准参照NIH＆WTO（2000）标准，对听力损失的评定：以相对好耳（优侧耳）0.5、1.0、2.0、4.0kHz频率的气导平均值（PTA）为基准评定听力损失的程度：<25dBHL为听力正常，26-40dBHL为轻度，41-70dBHL为中度，71-95dBHL重度，>95dBH L为极重度。

1.4Sequenom MassARRAY特定SNP基因分析检测

对所有研究对象采集外周静脉血3-5m l用于基因组DNA的抽取。抽提志愿者DNA后，先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分在真空管中的飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子真量，从而检测出SNP位点信息（本部分工作在博奥生物技术有限公司完成）。引物序列如下：rs1981361A等位基因序列：5’-CAGAG⁃GCCTAGCGACC-3’rs1981361PCR上游引物1：5’–ACGTTGGATGGGGAAATGCACGTTTAGCAG-3’, rs1981361PCR上 游 引 物 2：5’-ACGTTGGAT⁃GTTTCACCAAACCACTGGCTC-3’,rs1981361延伸引物1：5’-CAGAGGCCTAGCGAC-3’,rs1981361延伸 引 物 2：5’-CAGAGGCCTAGCGACT-3’；rs2127034T等位基因序列：5’-CAGAGGCCTAGC⁃GACC-3’rs2127034 PCR上游引物1：5’–ACGTTG⁃GATGCAGAGTTGAGAAGGCTGCAC-3’,rs2127034 PCR上游引物2：5’-ACGTTGGATGGAGAAAAA⁃CAGTCCTCAAGC-3’,rs2127034延 伸 引 物 1：5’-CAAGCACACATTAACCCC-3’,rs2127034延伸引 物2：5’-CAAGCACACATTAACCCT-3’；rs10955255A等位基因序列：5’-AGACAATTTTGT⁃GAATCACTT-3’rs10955255PCR上游引物1：5’–ACGTTGGATGGTTCCCATTTTGTCTGTTTTC-3’, rs1095 5255PCR上游引物2：5’-ACGTTGGATG⁃GATGTGACAATTCTCTTCTG-3’,rs10955255延伸引物 1：5’-AGACAATTTTGTGAATCACTTC-3’, rs10955255延伸引物2：5’-AGACAATTTTGTGAAT⁃CACTTT-3’。

2　结果

2.1一般资料

所有志愿者都是来自哈尔滨市区或郊区的汉族老年人，均没有吸烟及饮酒史,生活规律,没有致耳聋药物应用史。病例组（老年耳聋组）224人，平均年龄61.92岁，听力下降至少25dB以上，正常组225人，平均年龄57.88岁，听力下降小于25dB。ANOVE分析结果显示，病例-对照组间的年龄和性别分布均无统计学差异（P>0.05）。

2.2多态位点基因型和等位基因在各组间分布情况

选取GHRL2基因中的三个SNP位点：rs10955255,rs2127034和rs1981361作为研究对象。首先，对于rs1981361，GRHL2(AA/AG/GG)基因型分布在对照组和病例组存在显著差异，如表1，图1所示。

表1　两组GRHL2基因rs1981361多态性基因型分布及等位基因分布与比较（n=449）

图1　GRHL2基因rs1981361多态性基因型分布及等位基因分布图

其次，对于rs1981361，GRHL2(CT/CC/TT)基因型分布在对照组和病例组不存在显著差异，如表2，图2所示。

表2　两组GRHL2基因rs2127034多态性基因型分布及等位基因分布与比较（n=449）

图2　GRHL2基因rs2127034多态性基因型分布及等位基因分布图

再次，对于rs 10955255，GRHL2(AA/GA/GG)基因型分布在对照组和病例组不存在显著差异，如表3，图3所示。

表3　两组GRHL2基因rs10955255多态性基因型分布及等位基因分布与比较（n=449）

图3　GRHL2基因rs10955255多态性基因型分布及等位基因分布图

3　讨论

在未来的近半个世纪中，我国老年人口将呈迅速增长的发展趋势，随着我国老龄化社会的全面到来，老年性疾病的发病率及患病率也急速上升，其中，老年性聋是人类常见的听力疾病。随着年龄的增长，人体的不同组织和各类器官，逐渐发生老化，当累积听觉系统时，出现听力下降、言语识别率降低，从而发生老年性耳聋。从宏观的角度来讲，老年性耳聋不是老年人特有的疾病，而是指与年龄相关而排除其他原因后所发生的听力下降，发表年龄尚未有明确的界定。老年性耳聋的发病率很高，属于多基因疾病范畴，具有高度异质性，是遗传和环境因素共同作用的结果[5，6]。据调查，15-20%的成年人及50%以上的超过80岁的老年人有25分贝或以上的听力损失。听力下降严重影响老年人的生活质量,甚至导致老年人的心理、生理疾病[7]，严重影响老年人生活质量。

耳聋是一种具有显著遗传异质性的疾病，耳聋的基因型和表型之间存在着一定的因果对应关系，老年性耳聋并不是一种统一的疾病，可以由多种因素引起，其出现年龄、发展速度、听力损失的程度及对生活的影响等方面因人而异。老年性耳聋是环境因素及遗传因素共同作用的结果[1-2,8]，遗传因素在老年性耳聋发病机制方面的作用越来越受到关注，有人估计40%-50%的老年性耳聋与遗传有关[3]，认为个体遗传背景决定了老年性耳聋表型的差异。针对老年性聋遗传易感性分子机制的研究相对较少,其进展比较缓慢。

Grainyhead基因编码果蝇属的转录因子,在果蝇生长发育过程中有重要的调节作用。GRHL属于果蝇属基因Grainyhead基因的同系物[9],其家族中共有三个成员:GRHL1、GRHL2和GRHL3,这三种基因在胚胎发育过程中具有相同的重要性,但GRHL2对于内耳功能的维持作用显著,GRHL2编码转录因子在许多上皮组织中广泛表达[10],在内耳,GRHL2主要在蜗管的细胞系中表达,在胚胎发育阶段起到至关重要的作用,同时在出生后的上皮细胞功能维持方面具有重要性[11]。现已明确 GHRL2基因的rs10955255与欧洲老年性聋遗传易感因素具有强关联性[4],同时有报道指出，GRHL2基因SNP位点与台湾汉族人老年性耳聋遗传易感的不具有相关性[12]。说明GRHL2基因的SNP位点有地域性差异，地区性筛查GRHL2的SNP位点，对于诊疗老年性耳聋，改善老年人的生活质量，有重要意义。

本文资料显示老年性耳聋组GRHL2基因rs1981361 SNP位点GA基因型频率较正常对照组高，而GG基因型频率较正常对照组低，其差别有显著性，提示此位点可能与哈尔滨区域老年性耳聋的发病有关。另外，本文资料显示老年性耳聋组rs2127034和rs10955255等位基因位点基因型频率与正常对照组无显著性差异，提示这两个位点可能与老年性耳聋无相关性。但是该结果并不排除GRHL2基因的其他SNP位点与老年性耳聋的相关性，对于GRHL2基因的深入研究也许能够进一步说明这一问题。

有文献报导，老年性耳聋疾病中存在一系列的易感基因。Van Eyken报导，KCNQ4基因与老年性耳聋具有相关性[13]。在解毒和新陈代谢过程中有一种由NAT2编码的酶，该酶已有文献证实与老年性耳聋具有相关性[14,15]。Yan-Han Lin等证实，在台湾汉族人群中，GRHL2的单核苷酸多态性与老年性耳聋没有相关性[12]。Van Laer所做的2418例病人的相关性分析证明，GRHL2基因内含子1中的单核苷酸多态性与欧洲人老年性耳聋具有相关性[4]。

本文与上述文献的报导不一致，主要原因可能在于群体的差异性和基因的变异性，但也不排除不同的生活环境所造成的适应性改变等原因。这些相关性可能只适用于某些特定人群，同时也要考虑由于样本量小而造成的结果偏差。另外，由于不同实验组所使用的仪器和判定标准的误差，所形成的数据误差也是需要考虑的因素之一。

本文中，我们首次选取了哈尔滨地区汉族老年人，分别检测对照组和老年性耳聋组GRHL2基因的三个SNP位点，筛查到GRHL2基因rs1981361 SNP位点与哈尔滨地区老年性耳聋遗传易感性具有相关性。本研究结果显示，在中国东北寒冷地区的哈尔滨市，GRHL2基因rs1981361的SNP位点与老年性聋的遗传易感性有一定的关系，这为进一步的大规模、多中心、多学科的研究老年性耳聋奠下了基础。

1Viljanen A,Era P,Kaprio J,etal.Genetic and environmental influ⁃ences on hearing in older women.JGerontol A Biol Sci Med Sci, 2007,62(4):447-498.

2Christensen K,Frederiksen H,Hoffman HJ.Genetic and environ⁃mental influences on self-reported reduced hearing in the old and oldestold.JAm Geriatr Soc,2001,49(11):1512-1518.

3Gates GA,Couropmitree NN,Myers RH.Genetic associations in age-related hearing thresholds.Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1999,125(6):654-662.

4杨仕明,吴南.攻克感音神经性耳聋治疗难题的基础研究.中华耳科学杂志.2013,11（3）:329-334.

5Van Laer L,Van Eyken E,Fransen E,et al.The grainyhead like 2 gene(grhl2),alias tfcp2l3,isassociated with age-related hearing im⁃pairment.Hum MolGenet,2008,17(2):159-227.

6viljanen A,Era P,Kaprio J,etal.Genetic and environmental influenc⁃es on hearing in older women.JGerontol A Bid SciMed Sci.2007, 62:447-452.

7Christensenk,Frederiksen H,Hoffman HJ.Genetic and environmental influences on self-reported reduced hearing in the old and oldest.J Geriatr Soc,2001,49(11):1512-1517

8Dalton DS,Cruickshanks KJ,Klein BE,etal.The impactof hearing loss on quality of life in older adults.Gerontologist,2003,43(5): 661-668.

9Viljanen A,Kaprio J,Pyykko I,et al.Genetic and environmental in⁃fluences on hearing at different frequencies separately for the better and worse hearing ear in older women.Int JAudiol,2007,46(12): 772-780.

10Auden A,Caddy J,Wilanowski T,et al.Spatial and temporal ex⁃pression of the grainyhead-like transcription factor family during murine development.Gene Expr Patterns,2006,6(8):964-1033.

11Wilanowski T,Tuckfield A,Cerruti L,etal.A highly conserved nov⁃el family ofmammalian developmental transcription factors related to drosophila grainyhead.Mech Dev,2002,114(1-2):37-50.

12Lin YH,Wu CC,Hsu CJ,et al.The grainyhead-like 2 gene(grhl2) single nucleotide polymorphism is not associated with age-related hearing impairment in han chinese.Laryngoscope,2011,121(6): 1303-1309.

13Gasparini P,Rabionet R,BarbujaniG,etal.High carrier frequency of the 35delg deafnessmutation in european populations.Genetic analysis consortium of gjb2 35delg.Eur JHum Genet,2000,8(1): 19-23.

14 Van Eyken E,Van LaerL,Fransen E,etal.Kcnq4:A gene forage-relat⁃edhearingimpairment?HumMutat,2006,27(10):1007-1022.

15UnalM,Tamer L,Dogruer ZN,etal.N-acetyltransferase2 gene poly⁃morphism andpresbycusis.Laryngoscope,2005,115(12):2238-2278.

16Lee CY,Hwang JH,Hou SJ,et al.Using cluster analysis to classify audiogram shapes.Int JAudiol,2010,49(9):628-660.

Correlation between presbycusisamong ethnic Han peop le in Harbin and single nuceotide polymorphism of GRHL2

ZHOUBin,XUPing,CUIzhongtao,FENGmiao,BAIzhigang,MAXiaonan,LITingting
DepartmentofOtolaryngology,Fourth Affiliated HospitalofHarbinMedicalUniversity
Corresponding author:XUPing,Email：hydxpdoctor@163.com

Objective To study the correlation between presbycusis among the Han ethnic group in Harbin area and single-nucleotide polymorphism(SNP)of GRHL2 and determ ine if there isGRHL2 genetic predisposition to presbycusis.M ethods Two hundred and twenty five normalhearing(audiometric thresholds at25 dB HL orbetter)ethnic Han people older than 50 years(the controlgroup)and 224 Han people older than 50 yearsw ith hearing thresholds greater than 25 dB HL(the study group)in urban or suburban areasof Harbinwere included in the study,The Sequenom MassARRAY specific SNPgene analysismethod was employed to analyze genotype frequency and allele frequency in each group.χ2-testwas used in statistical analysis to evaluate differencesbetween groups.Results Therewasno difference in respect to the distribution of genotypesor alleles between these two groups(P>0.05)byχ2-test.Distributions of genotypes and alleles of rs10955255 and rs2127034 SNP in both groups attained Hardy-Weinberg balance.Distributions of genotypes and alleles of rs1981361 SNP did notattain Hardy-Weinberg balance in the two groups(P<0.05 byχ2-test).Conclusion There appears to be a correlation between presbycusis among the Han people in Harbin and the GRHL2 rs1981361 SNP.The GRHL2 genemay be ameaningful gene for research on genetic susceptibility to presbycusis.Our results provide thebasis for future relevant large-scalemulticenterstudies.

Presbycusis,GRHL2,single-nucleotide polymorphism

R764.43

A

1672-2922（2015）03-529-04

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.03.034

黑龙江省政府博士后资助基金项目编号LRB2010-320；黑龙江省青年科学基金项目编号QC2011C029

周彬，副主任医师，副教授,医学博士，硕士研究生导师，研究方向：耳聋的临床及基础研究

徐平，Email：hydxpdoctor@163.com

2014-9-15 审核人：郭维维)