鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌qacEΔ1基因检测及消毒剂抗性研究

刘文秀 崔红霞 韩爽 刘大鹏 徐菲 张宏宇 房丹丹 王雪婷

161000 齐齐哈尔市，齐齐哈尔医学院药学系（崔红霞）

鲍曼不动杆菌是氧化酶阴性、不发酵糖类的革兰氏阴性杆菌。铜绿假单胞菌是假单胞菌属的代表菌，属非发酵条件下致病菌。近年来，随着抗生素的广泛应用或某些介入性检查／治疗的采用，多重耐药的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌已经成为医院感染的重要致病菌，甚至成为重症监护病房、急诊科及外科病房的定植菌。细菌的耐药现象不仅表现在耐抗生素上，而且已经扩展到耐消毒剂。此类耐消毒剂菌株的出现可能会导致医院消毒的失败，甚至导致医院内感染的暴发。有报道［1］显示，qac基因的外排泵可将季铵盐类化合物排出菌体，其中由整合子介导的qacEΔ1基因可被革兰氏阴性菌获取，从而产生对消毒剂的抗性。本文研究以我院临床分离的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌为目标菌，了解其携带qacEΔ1耐消毒剂基因情况，并探讨该基因对医院常用消毒剂碘伏、含氯制剂和快速手消毒剂的消毒效果的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集我院2012年1月至2014年12月临床分离的鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌各30株，剔除同一患者相同部位的重复菌株，所有菌株均经过法国梅里埃ATB1525型细菌鉴定仪进行鉴定。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853均购自卫生部临床检验中心。

1.2 耐消毒剂基因qacEΔ1的检测

1.2.1 DNA模板的制备 用 5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）将菌龄18－24 h的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌培养物洗下，取1 ml菌悬液置于1.5 ml Eppendorf管中，11 000×g离心 2 min，弃上清。加入 200μl无菌纯水重悬，在沸水中煮10 min后，立即在冷水中冷却，11 000×g 离心 2 min，取上清液 2.5 μl作为DNA模板进行PCR反应。

1.2.2 PCR引物 按美国国立生物技术信息中心（ncbi）已登录的 qacEΔ1 基因序列（登录号 u12338）自行设计引物。由上海生工生物工程有限公司合成，引 物 序 列 为 ：qacEΔ1－F TAGCGAGGGCTTTACTAAGC，qacEΔ1－R ATTCAGAATGCCGAACACCG，目标产物长度为300 bp。

1.2.3 PCR 反应 PCR 反应体系：10×PCR 缓冲液2.5 μl，dNTP（2.5 mmol／L）2 μl，ExTaqDNA 聚合酶（5 U／μl）0.3 μl，qacEΔ1－F（10 μmol／L）1.0 μl，qacEΔ1－R（10 μmol／L）1.0 μl，DNA 模板 2.5 μl，无菌纯水补足至 25.0 μl。热循环参数为：94 ℃预变性 5 min→94℃30 s→55℃30 s→72℃60 s，共循环30周期，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.4 PCR 反应产物检测 取 PCR 产物 5μl，在1%琼脂糖凝胶上以120 V电压电泳20 min，用凝胶成像系统观察并拍照。

1.3 消毒剂抗力试验

1.3.1 菌悬液制备 取各实验菌培养18－24 h的新鲜斜面培养物，用含1000 mg／L胰蛋白胨的生理盐水稀释液（TPS）洗下菌苔，经充分震荡混匀，稀释配置成菌含量为 1×107～1×108CFU／mL 的菌悬液。

1.3.2 试验消毒剂 含碘消毒剂：碘伏，含有效碘5000 mg／L，用硬水稀释成 75 mg／L、150 mg／L 及300 mg／L备用；含氯消毒剂：氯片，含有效氯500 mg／L； 分别用硬水稀释成 125 mg／L、250 mg／L 及500 mg／L备用。醇类消毒剂：百能免洗手消毒液，原倍使用。

1.3.3 中和剂 经中和剂鉴定试验确定，碘伏中和剂为10 g／L硫代硫酸钠＋3 g／L吐温80的营养肉汤；含氯制剂的中和剂为5 g／L硫代硫酸钠＋1 g／L吐温80的营养肉汤；快速手消毒液的中和剂为2 g／L卵磷脂＋20 g／L吐温80的营养肉汤。

1.3.4 悬液定量杀菌试验 在无菌试管中加入1.0 ml试验用菌悬液和4.0 ml试验浓度消毒剂（阴性对照用磷酸盐缓冲液），混合均匀，分别作用1 min、5 min和7 min。取 0.5 ml混合液加入到含 4.5 ml相应中和剂的试管中混合均匀，然后取1.0 ml混合液倾注法接种培养，37℃培养48 h后进行活菌计数，试验重复3次，计算平均灭菌率。

1.4 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件对数据进行统计学分析。平均灭菌率采用±s表示，qacEΔ1基因阳性菌株和阴性菌株间平均灭菌率比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌携带qacEΔ1基因情况 在30株鲍曼不动杆菌中，有22株携带qacEΔ1 基因，阳性率为 73.3%（22／30）。在 30 株铜绿假单胞菌中，有18株携带qacEΔ1基因，阳性率为 60.0%（18／30）。标准菌株大肠埃希菌 ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853的qacEΔ1基因检测均为阴性，图1为耐消毒剂qacEΔ1基因PCR产物电泳图。

图1 耐消毒剂qacEΔ1基因PCR产物电泳图

2.2 目标菌携带qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株对碘伏的抗力试验结果 有效碘对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌及质控菌株的灭菌率均随时间和剂量的提高而提高，呈现明显的量－效关系和时－效关系。在灭菌1 min时，除300 mg／L有效碘对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌qacEΔ1基因阳性菌株灭菌率均低于基因阴性菌株，且差异均有统计学意义（P均＜0.05）外，其他浓度下有效碘对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株灭菌率差异均无统计学意义（P均＞0.05）。其他作用时间下不同浓度有效碘对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌qacEΔ1基因阳性菌株的灭菌率均低于qacEΔ1基因阴性菌株，且差异均有统计学意义（P均＜0.05），详见表1。

2.3 目标菌携带qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株对有效氯的抗力试验结果 有效氯对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌及质控菌株的灭菌率均随时间和剂量的提高而提高，呈现明显的量－效关系和时－效关系。不同浓度的有效氯在作用5 min、7 min时对鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌qacEΔ1基因阳性菌株灭菌率均低于基因阴性菌株，且差异均有统计学意义（P均＜0.05）；在作用 1 min 时，500 mg／L 有效氯对鲍曼不动杆菌qacEΔ1基因阳性菌株灭菌率低于阴性菌株，且差异有统计学意义（P＜0.05），但对铜绿假单胞菌qacEΔ1基因阳性与阴性菌株灭菌率差异无统计学意义（P＞0.05），详见表2。

2.4 目标菌携带qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株对快速手消毒剂的抗力试验结果 快速手消毒剂对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌及质控菌株的灭菌率均随时间的延长而提高，呈现明显的时－效关系。快速手消毒剂在作用1 min、5 min和7 min时对鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌qacEΔ1基因阳性菌株灭菌率均低于基因阴性菌株，且差异均有统计学意义（P均＜0.05），详见表3。

3 讨论

鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌是临床各科室尤其是重症监护室和急诊室的常见条件致病菌。随着消毒剂的广泛使用，细菌的耐药现象不仅局限在耐抗生素方面，某些细菌在亚致死量消毒剂或消毒剂使用时间不当的长期作用下，会使菌株保存下来，诱导细菌对消毒剂产生抗性［2］。与耐抗生素菌株一样，耐消毒剂菌株的出现同样会导致医院消毒的失败及院内感染的发生。

qacE基因家族表达细菌多种化合物外排泵（外排消毒剂耐药）。qacE基因家族已报道的亚型有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacJ。qacEΔ1是I类整合子的一部分，由整合子介导，可被革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌广泛获取［3］。有报道［1，4］指出，鲍曼不动杆菌不仅对常用抗生素耐药性较高，而且qacEΔ1基因携带率也较高。本文研究结果显示，我院携带qacEΔ1耐消毒剂基因的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的阳性率分别为73.3%和60.0%，虽低于黄支密等［5］报道的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌qacEΔ1基因携带率为80%，但同样不容忽视。

本文研究采用定量杀菌试验检测携带qacEΔ1基因的菌株对临床3种常用消毒剂抗力的影响，结果显示，携带有qacEΔ1基因的鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌对有效碘、有效氯及快速手消毒剂的抗力均高于qacEΔ1基因阴性菌株，并且3种消毒剂对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌及质控菌株的灭菌率均随时间和剂量的提高而提高，呈现明显的量－效关系和时－效关系。由表1可见，当有效碘浓度达到300 mg／L，且灭菌时间达 7 min以上时，其对qacEΔ1基因阴性的鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌的灭菌率可达100.0%，但对qacEΔ1基因阳性的菌株的灭菌率均在90.0%以下，提示对于qacEΔ1基因阳性菌株，为达到完全灭菌的效果，应继续提高有效碘的浓度或延长灭菌时间。由表1、表2及表3综合分析可知，对于qacEΔ1基因阳性的鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌，本文研究所设定的3种消毒剂的最高浓度及最长作用时间均未达到100%灭菌，因此为达到完全灭菌，应通过提高消毒剂的有效浓度或延长灭菌时间来实现，即所采用的3种消毒剂的浓度及作用时间均应高于本文研究所设定的最高值，但最佳的灭菌浓度及时间仍应通过后续试验来完善。本文研究的关键之处在于证明两种目标菌的qacEΔ1基因阳性菌株比qacEΔ1基因阴性菌株对消毒剂的抗性要强，表现在同等条件下消毒剂对qacEΔ1基因阳性菌株的灭菌率低于阴性菌株。

表1 目标菌携带qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株对碘伏的抗力试验结果（±s，%）

表1 目标菌携带qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株对碘伏的抗力试验结果（±s，%）

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表2 目标菌携带qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株对有效氯的抗力试验结果（±s，%）

表2 目标菌携带qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株对有效氯的抗力试验结果（±s，%）

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表3 目标菌携带qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株对快速手消毒剂的抗力试验结果（±s，%）

表3 目标菌携带qacEΔ1基因阳性菌株与阴性菌株对快速手消毒剂的抗力试验结果（±s，%）

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综上所述，耐消毒剂qacEΔ1基因阳性菌株的出现使医院感染面临新的挑战。消毒剂的长期不正确使用是导致该类菌株出现的主要原因，因此在使用消毒剂进行消毒时，一定要保证消毒剂的有效浓度和足够的消毒时间［6］。正确合理使用消毒剂是加强院内感染控制的前提，在监测到院内多重耐药菌上升的同时进行qacEΔ1耐消毒剂基因的检测，可为消毒剂的正确使用做出指导。

1 Kucken D，Feucht H，Kaulfers p.Association of qacE and qacE Delta1 with multipleresistancetoantibioticsand antisepticsin clinical isolates of Gram－negative bacteria.FEMSMicrobiol Lett，2000，183：95－98.

2 Shiraishi T，Nakagawa Y.Review of disinfectant susceptibilty of bacteria isolated in hospital to commonly used disinfectants.Postgrad Med J，1993，69：S70－S77.

3 吴晓松，陈越英，谈志，等.三种革兰氏阴性杆菌耐消毒剂基因检测及对苯扎溴铵抗性研究.中国消毒学杂志，2009，26：249－251.

4 何晓峰，刘芳，曹晋桂，等.多重耐药革兰氏阴性杆菌耐消毒剂基因 qacEΔ1 监测.中国感染控制杂志，2011，10：97－99.

5 黄支密，糜祖煌，石晓霞，等.医院感染革兰氏阴性杆菌耐消毒剂基因研究.中华医院感染学杂志，2005，15：721－724.

6 张本，刘衡川，张朝武，等.大肠杆菌015：H7对含氯消毒剂连续消毒抵抗力的变化及与质粒po157关系的研究.现代预防医学杂志，2003，30：634－637.