化浊行血颗粒对动脉粥样硬化模型大鼠颈总动脉NF-κB的作用※

胡怀强周永红张皓

（1中国人民解放军济南军区总医院神经内科，济南250031；2青岛大学医学院，青岛266021）

化浊行血颗粒对动脉粥样硬化模型大鼠颈总动脉NF-κB的作用※

胡怀强1周永红2*张皓2

（1中国人民解放军济南军区总医院神经内科，济南250031；2青岛大学医学院，青岛266021）

目的研究化浊行血颗粒对食饵性动脉粥样硬化模型大鼠颈总动脉核因子-κB的影响，探讨中药治疗AS的有效方法。方法实验动物按质量随机分为正常对照组、模型组和药物组，每组12只，采用高脂饲料法建立大鼠食饵性AS模型。建模后，药物组灌胃给予化浊行血颗粒水溶液（12 g生药/kg·d），正常对照组、模型组分别给予等容量的蒸馏水，连续8周。免疫印迹法观察NF-κB表达。结果与正常对照组比较，模型组和药物组NF-κB均显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，药物组NF-κB显著降低（P＜0.01）。结论化浊行血颗粒可有效拮抗核因子-κB，从而抑制AS的发生、发展。

化浊行血颗粒；动脉粥样硬化；核因子-κB；动物实验

以动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）为主要病理基础的慢性疾病严重威胁人类健康，已经成为我国的重大公共卫生问题［1］，防治AS具有重要的健康效应和经济效应［2］。AS发病机制复杂，单一环节药物作用无法取得满意效果，中药因其具有多种生物学活性、多靶点治疗作用而备受关注。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化可诱发AS产生并加重其发展［3-4］，成为动脉粥样硬化及其相关并发症的潜在治疗靶点，本文观察了中药对食饵性AS大鼠颈总动脉NF-κB的作用，以期寻找新的有效治疗AS的中药复方。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物成年SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，体重250～300 g，由山东大学实验动物中心提供，实验动物生产许可号：SCXK（鲁）20090001（山东省科学技术厅发），实验动物质量合格证号：鲁动质号1205215（山东省实验动物管理委员会发），检疫后备用，自由摄食进水。颗粒大鼠饲料，由济南康大饲料与山东省实验动物中心联合生产，许可证号：鲁饲准字364号。实验过程中动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。

1.1.2 实验药物化浊行血颗粒，主要由荷叶、焦山楂、决明子、制水蛭、酒大黄、赤芍、路路通、虎杖、何首乌等组成，由山东鲁信药业有限公司生产（批号：2012031701），并按照成人剂量的20倍（12 g/kg/d）将其制成水溶液，浓度为1.2 g/ml（即1 ml/100 g），置于4℃冰箱中备用。

1.1.3 主要试剂NF-κB抗体，美国Sigma公司；细胞及组织总蛋白抽提试剂盒，上海康成生物工程有限公司；BCA蛋白质定量试剂盒，上海康成生物工程有限公司；浓缩型DAB试剂盒，北京中杉金桥生物科技有限公司；Tris，美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 分组方法实验动物购买后，在实验室内适应性饲养1 w，1 w后按体重随机分为正常对照组、模型组和药物组，每组大鼠各12只。因灌胃致吸入性肺炎模型组死亡2只、药物组死亡1只。

1.2.2 造模方法参照文献［5］建立大鼠食饵性AS模型，AS大鼠（包括药物组和模型组）喂食高脂饲料（配方：3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料），同时在喂食开始时一次性腹腔注射维生素D 60万IU/kg。对照组按照体重给予同等体积的生理盐水。连续喂12周。

1.2.3 给药方法造模后，药物组灌胃给予化浊行血颗粒水溶液，剂量为12 g生药/kg/d（相当于70 kg成人每日10倍用量）；正常对照组、模型组分别给予等容量的蒸馏水，连续8周。

1.2.4 动物处理与取材给药结束后禁食8 h，100 g/L水合氯醛腹腔注射（300 mg·kg）麻醉动物，分离颈总动脉血管，用生理盐水冲洗后置于多聚甲醛后固定液（含0.1%DEPC）、4%戊二醛溶液中固定，参照文献［6-7］制备颈总动脉提取物，于-80℃冰箱保存备用待测。

1.2.5 颈总动脉NF-κB表达采用免疫印迹法（Western blot）观察。蛋白质抽提，按照BCA蛋白质定量试剂盒说明书操作进行BCA蛋白定量测定。SDS-PAGE电泳：制备分离胶、制备积层胶、样品准备，加入电泳缓冲液，上样电泳，使用BioRad电泳装置，样品首先在80V恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端，然后120V恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部，凝胶电泳于4℃。蛋白转移，膜的封闭和抗体孵育：膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合，封闭过的膜加入一抗体4℃过夜，抗原抗体结合，加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。TKCTM化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育3分钟，去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光，对胶片进行扫描，图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

1.2.6 统计学方法所有资料数据用SAS8.1版统计软件进行分析。计量资料采用t检验、q检验；组间比较用单因素方差分析，所用计量资料均采用（x±s）（均数±标准差）表示。P为双侧检验，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异。

2 结果

与正常对照组比较，模型组和药物组NF-κB均显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，药物组NF-κB显著降低（P＜0.01）（见表1）。

表1 免疫印迹法观察大鼠颈总动脉NF-κB表达的变化

3 讨论

AS是一种复杂的血管炎性疾病，炎症反应贯穿其发生、发展的全过程［8］。研究发现，AS炎症病变过程中炎性细胞的激活和炎性细胞因子的释放与NF-κB的激活密切相关［9-10］。NF-κB属于Rel蛋白家族，该家族包括一系列结构和功能相关的蛋白质，在机体多种生物学活性物质的转录调控过程中均起着重要作用，因而被称为核转录因子NF-κB。激活的NF-κB进入胞核与相应靶序列结合，调节相关靶基因的转录活性，参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡和自由基损伤等病理生理过程［11］，NF-κB的活化可以调节多种致AS炎症基因的表达，并通过炎症因子之间的连锁放大效应加速AS的形成［12］。在形成AS的复杂网络结构中，NF-κB的活化是导致动脉粥样硬化一个中心环节［3-4］，因而对NF-κB进行干预，可有效控制AS的发生和发展。

中医学认为，血浊是AS的病理枢纽，清化血浊可调整脏腑功能状态，增强脏腑功能，使气旺血和，血脉畅通，瘀祛新生，气化复常，痰浊得消，经络得通，为AS的基本治法。化浊行血颗粒主要由荷叶、焦山楂、决明子、制水蛭、酒大黄、赤芍、路路通、虎杖、何首乌等药物组成，该方一可化浊，清化血中浊邪，恢复血液的清纯精专状态；二可行血，及时改善血浊带来的血行障碍以及脉道紊乱状态［13］，充分体现了清化血浊的治疗方法。该方是本课题组使用多年的临床经验方，在治疗AS方面有较好的疗效［14］。

本文观察了化浊行血颗粒对AS模型大鼠颈总动脉NF-κB的影响，研究结果显示，模型组中大鼠颈总动脉NF-κB较正常对照组明显升高，二者之间有显著性差异（P＜0.01），表明高脂饲料喂养可激发大鼠动脉内NF-κB活化，从而诱发、加重动脉粥样硬化的发生、发展。药物组大鼠颈总动脉NF-κB较正常对照组升高，但较模型组明显降低，且三组之间有显著性差异（P＜0.01），说明化浊行血颗粒可有效抑制食饵性动脉粥样硬化模型大鼠颈总动脉NF-κB表达，表明清化血浊法可有效抑制动脉粥样硬化的发生、发展。

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Effect of the Huazhuo Xingxue Granules on NF-κB in the Common Carotid Artery of Atherosclerosis Rats

HU Huaiqiang1，ZHOU Yonghong2，ZHANGHao2
（1.Department of Neurology，the General Hospital of Jinan Military Command，Jinan250031，China；2.Medical College of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao266021，China）

Objective To explore the effect of Huazhuo Xingxue granules on nuclear factor kappa B（NF-κB）in the common carotid artery of atherosclerosis rats.Methods The rats were randomly divided into control，model，and medicine groups.The medicine group was administrated with Huazhuo Xingxue granules for a course of 8 weeks after the atherosclerosis model rats were established by high fat diet.The control group and model group were taken orally equivolumetric distilled water.NF-κB was measured by western blotting.Results The NF-κB of model，medicine groups obviously increased，which were significantly difference with the control group（P＜0.01）.The NF-κB of medicine group was significantly less than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion Huazhuo Xingxue granules can resist NF-κB to inhibit the development of atherosclerosis.

Huazhuo Xingxue granules；atherosclerosis；nuclear factor kappa B；animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.10.070

1672-2779（2015）-10-0136-03

：张文娟本文校对：毛妮

2015-04-09）

山东省自然科学基金（No：ZR2010HM109）；山东省优秀中青年科学家基金（No：2009BSB02208）

*通讯作者：qduzyh@126.com