环境水体中病原微生物与指示微生物的相关性研究

陈胜蓝，尹红果，陈梦清，陈 松，郑圆圆，Randy A Dehlgren，2，3，张明华，2，3，商 栩*

（1.温州医科大学 水环境应用技术研究所，浙江 温州 325035；2.湖南环境生物职业技术学院 护理学院，湖南 衡阳 421005；3.美国加州大学戴维斯分校 土壤、大气与水资源系，加州 戴维斯 95616）

环境水体中病原微生物与指示微生物的相关性研究

陈胜蓝1，尹红果1，陈梦清1，陈 松1，郑圆圆1，Randy A Dehlgren1，2，3，张明华1，2，3，商 栩1*

（1.温州医科大学 水环境应用技术研究所，浙江 温州 325035；2.湖南环境生物职业技术学院 护理学院，湖南 衡阳 421005；3.美国加州大学戴维斯分校 土壤、大气与水资源系，加州 戴维斯 95616）

对夏、冬两季温瑞塘河水体中病原微生物与常用指示微生物粪大肠杆菌和大肠埃希菌的关系进行了研究，针对水环境中伤寒沙门氏菌建立了环介导等温扩增技术的快速检测方法。结果显示，温瑞塘河水体中微生物污染较严重，粪大肠菌群数量高达1.10×103～1.40×107mL-1，超过60%的站位微生物污染程度超过地表水V类水质标准。大肠埃希菌浓度为1.00×104～5.08×106m L-1，且这2种常用的指示微生物间表现出较高的相关性。不同污染程度的水体中伤寒沙门氏菌的检出率差异显著，且夏季的检出率要高于冬季。在粪大肠杆菌浓度低于104m L-1的水样中，未能检出伤寒沙门氏菌；但水样中粪大肠杆菌浓度高于104m L-1时，伤寒沙门氏菌的检出率随粪大肠杆菌浓度上升而上升；当水体中粪大肠杆菌浓度超过106m L-1时，伤寒沙门氏菌的检出率达100%。本研究结果表明，常用的水环境指示微生物能够在一定程度上反映水体病原微生物的污染情况，但在具体应用中需考虑到污染源及水体理化条件等差异。

环境水体；病原微生物；指示微生物；相关性

近年来，新发、突发的重大传染病对人民生命健康和经济社会发展带来的严重威胁，特别是2003年SARS、2005年禽流感、2009年 H1N1流感等突发传染病疫情的发生，给全人类敲响了警钟，世界各国都开始从不同角度重新审视各种潜在的环境安全问题。世界卫生组织 （WHO）指出传染性疾病的出现和再现现象中，约有75%的新型病原体来自于人畜共患病［1］，而疾病的重要传播媒介地表水又极易受到人类和动物活动的污染［2］。据报道，发展中国家各种传染病中有90%与水污染有关，全球每年大约有300万至400万人，其中包括200多万儿童，直接死于因饮用不洁净的水而引起的疾病。目前，水媒传播引起的疾病仍是我国急性传染病中发病数最多，流行面最广的一类疾病，水体病原微生物污染问题的研究与解决迫在眉睫。

由于水中致病微生物生物量少且检测难度大，因此往往通过检测指示微生物来评估水体病原菌的污染状况［3-4］。指示微生物法可靠与否取决于其是否真实反映了致病微生物在水体中的分布情况，但目前对二者在环境水体中的关联性研究还较少，运用指示微生物法进行致病微生物风险评估存在许多不确定性。沙门氏菌在环境中普遍存在，可通过人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接地污染水体，引起结肠炎、痢疾、心内膜炎、心包炎、脑膜炎等疾病，是重要的病原微生物检测指标。但鉴于当前国内外关于沙门氏菌检测方法如培养法、免疫学方法、分子生物学方法等普遍存在检测费时费力，价格昂贵及灵敏度不稳定等诸多不利因素［5-8］，本文选择了最新的分子生物学快速检测方法环介导等温扩增技术对沙门氏菌进行检测分析，再结合传统培养方法检测环境水体常用指示微生物粪大肠杆菌和大肠埃希菌的含量，以期获得指示微生物和致病菌在江南典型城市平原河网水体中的时空分布规律，并进一步探讨二者在水环境中被检出结果之间的关联性，为水体潜在的疾病风险预测提供依据。

1 材料与方法

1.1 水样采集

温瑞塘河位于中国浙江省温州市瓯江以南、飞云江以北的温瑞平原，水源主要来自瞿溪、熊溪、郭溪三大源头，水域面积22 km2，流域面积740 km2，灌溉面积321.3 km2，水系河网总长度1 178.4 km，多年平均降雨量1 694.8 mm，被当地人称为 “母亲河”。

本研究以整个温瑞塘河为研究区域，在国家标准 《采样方案设计技术》的基础上结合温瑞塘河的河网、地形地貌特征，于不同季节、特殊水文事件 （如台风）或水源性传染病高发时期，并且结合近几年冬夏季节对温瑞塘河40个常规检测点的传统培养大肠杆菌的检测结果，在温瑞塘河各主要类型河道中的常规监测站位、特定场所 （医院、养殖场）周边河道等设置5个站位采集水样 （图1），同时测定、记录水体基本理化参数，如表1所示。

图1 温瑞塘河流域河水微生物采样点分布图

表1 温瑞塘河各监测点的水质指标

1.2 沙门氏菌环介导等温扩增 （LAMP）快速检测方法

为研究水体沙门氏菌的分布情况，采集水样后，分别把500 mL各个采样点的水样过滤于0.45μm的微孔滤膜，然后用水体DNA提取试剂盒提取水中微生物的DNA，得到的基因组样品放入冰箱中备用。

选用伤寒沙门氏菌作为目标病原微生物，利用LAMP快速检测方法对其进行检测，扩增引物选择伤寒沙门氏菌（S.typhimurium CMCC 50115）的特异基因phoP的保守序列，引物序列由上海生工生物工程公司合成，具体序列如下：上游内部引物（Forward inner primer，FIP）5＇-GGCGTGAGAGATC CACCTGGAATGCGCCGTAATAGCGGTC-3＇，下游内部引物（Backward inner primer，BIP）5＇-CACCA TTATGGAAACGCTTATCCGCCGGATACAGCTGAAG CATC-3＇；上游循环引物（Forward loop primer， LF）5＇-CAGGTGATCAACATCCCGCC-3＇，下游循环引物（Backward loop primer，LB）；上游外部引物（Forward outer，F3）5＇-GCCATTCCACATCGAAGAG GT-3＇，下游外部引物（Backward outer，B3）5＇-ATGAGAACATCAATGGTATGGC-3＇。

LAMP反应体系为：F3与B3各5 pmol；BIP与FIP各40 pmol，其他反应组分浓度分别为：1.4 mmol dNTP，0.8 mmol Betain，8 mmol MgSO4，20 mmol·L-1Tris-HCl（pH值8.8，25℃），10 mmol·L-1KCl，10 mmol/L（NH4）2SO4，0.1% TritonX-100，BstDNA polymerase lμL（8 U），模板DNA 2μL，ddH2O补足体积到25μL。反应条件为63℃恒温反应1 h，80℃灭活10 m in。

1.3 水体指示微生物的测定

根据标准方法 （国家环保局 《水和废水检测分析方法》）进行水样的采集、保存及分析，并对水质细菌学指标粪大肠杆菌进行测定。粪大肠杆菌采用多管发酵技术，将不同水样按污染程度不同稀释3个接种量于适量乳糖蛋白胨培养基中进行初发酵，（37±0.5）℃恒温培养 （24±2）h，然后挑取各个阳性管 （产酸产气）中的菌体接种于EC培养液进行复发酵，（44±0.5）℃恒温培养 （24± 2）h，最后根据复发酵阳性管数量查询MPN最大或然数表，报告结果。

1.4 数据统计分析方法

试验数据使用Microsoft Excel 2007作图，利用SPSS v17.0统计学软件对粪大肠杆菌检出浓度值进行单样本K-S正态分布假设检验，从而判断分布规律。利用Spearman秩相关分析指示微生物和病原微生物是否具有显著相关性。

2 结果与分析

2.1 指示微生物的检测结果及分布特点

大肠埃希菌和粪大肠杆菌检测结果表明，粪大肠杆菌在各个采样点均有分布，数量高达1.1× 103～1.4×107m L-1，根据GB 3838—2002《地表环境质量标准》，超过60%的站位微生物污染程度超过地表水V类水质标准。大肠埃希氏菌的存在也比较广泛，除A3没有测出以外，其他监测点浓度值在1.0×104～5.08×106m L-1。根据浓度范围可知，处于人口分布密集的生活区内的C1站位和污染较轻的A3、W3站位，粪大肠杆菌浓度最大相差4个数量级，而大肠埃希氏菌浓度差也高达2个数量级 （图2、图3）。从季节变化情况看来，粪大肠菌群各个监测点中粪大肠杆菌浓度随季节变化而差异显著。除C1以外，A3、B7、B15和W 3监测站位的粪大肠杆菌浓度随季节变化明显，夏季均比冬季高 （图2、图3）。

图2 大肠埃希菌和粪大肠杆菌数的分布情况

2.2 伤寒沙门氏菌的时空分布特点

图3 粪大肠杆菌数量的季节分布

利用LAMP方法对伤寒沙门氏菌特异基因进行扩增、检测，各采样点伤寒沙门氏菌的阳性检出率如图4所示。由图可以看出，伤寒沙门氏菌在各个监测点所取的若干份水样中都有检测到，但阳性检出率之间存在一定的差异。污染较为严重的B7和C1两站位沙门氏菌的阳性检出率较高，为60%，B15站位为40%，而A3和W 3相应较低为20%。沙门氏菌季节分布特点如图5所示，由图可以看出，沙门氏菌阳性检出率在夏季高出冬季，夏季的阳性检出率为50%，而冬季为30%。

图4 不同站位沙门菌检测阳性率

图5 夏季和冬季沙门菌检测阳性率

2.3 病原微生物与指示微生物的关系

对粪大肠杆菌和大肠埃希菌进行皮尔森简单相关分析，结果表明，大肠埃希菌与粪大肠菌群在0.05水平上有显著相关性，相关系数为0.904，此结果与宋志文等人对人工湿地的研究结果相似［9］。对大肠埃希菌和粪大肠杆菌进行回归曲线估计，其线性关系结果如图6所示。

图6 粪大肠杆菌和大肠埃希菌的关系

为探讨沙门氏菌和指示微生物的相关性，将所有样品的沙门氏菌阳性检出率根据粪大肠杆菌浓度进行分级，结果如图7所示，由图可以看出，在粪大肠杆菌浓度低于104m L-1的水样中，未能检出伤寒沙门氏菌；但粪大肠杆菌浓度高于104m L-1时，伤寒沙门氏菌的检出率随粪大肠杆菌浓度增大而上升；当水体中粪大肠杆菌浓度超过106m L-1时，伤寒沙门氏菌的检出率达100%。

图7 沙门菌阳性率和粪大肠杆菌浓度的关系

3 讨论

环境水体中微生物的分布情况与各个站位所处的周边环境和水质状况等因素密切相关。本研究所选取的站位中，B7位于闸门口，与存在污水直排情况的瓯江相通，浊度较大；C1位于密集生活区内，大量生活废水、污水的外排，导致微生物大量滋生，水体污染相当严重，所以这2个站位水样中病原菌的阳性检出率也相应升高。国外大量研究者针对不同河流的不同区域的水体沙门氏菌进行了检测，结果表明，水域差异性导致检测到的沙门氏菌阳性率存在较大波动。Rajabi M等在萨旺尼河地表水的多个站位针对沙门氏菌的invA基因进行了检测，所有样本有96%为阳性结果［10］；Anselmo R J等对阿根廷的卢汉河沙门氏菌属进行了研究，收集的690份水样中分离出了434个阳性样本，阳性率达62.9%［11］。其他研究人员也分别对不同地区的水体沙门氏菌做了相应研究，其阳性检出率分别达到15.4%，8.5%，18.0%［12-14］。另外，相关研究结果表明水体沙门氏菌在不同时间、不同水生环境中的存在和丰度也有很大区别［15］，而且如果存在一种或多种不同的污水废水 （农业灌溉用水、被动植物排泄物污染的水等）一起排入河道，也会导致病原微生物检测的不确定性［16］。再者，也可能与沙门氏菌自身在环境中的存活能力有关［17］，沙门氏菌有13种不同的血清型，在环境中存活持久性存在较大差异。

从季节分布差异看来，本研究的检出情况是符合沙门氏菌本身的生物习性的，沙门氏菌能在10～42℃的环境下生长，最适宜生长的温度是 35～37℃。处于东南沿海的温州，夏季时间持续较长，气温高、雨水多，而沙门氏菌与温度和降雨呈正相关［17］，所以检出率较高。然而在温度逐降，环境干燥的冬季，温度、湿度和营养方面的条件不利于沙门氏菌生长，故其检出率也随之降低［18-19］。

有趣的是C1点的粪大肠杆菌数量在冬季较之夏季反而升高。其原因可能有以下2点，其一是该点位于人口密集的生活区内，所以废水污水及人畜粪便的排放可能是粪大肠杆菌的主要来源，另外即使是可行的垃圾处理过程也很难有效地减少源源不断注入的生活垃圾［20］；其二是C1站位直接接收人口密集区的生活污水排放，污水从产生到入河的时间间隔很短，水体中细菌量主要受排放量控制。而夏、冬两季污水排放量相当甚至冬季略高于夏季也是完全可能的。总体看来，河流粪大肠杆菌的数量大致在夏季较高，冬季较低。

指示微生物的监测可以为环境水体中疾病的风险评价提供一定的依据。周淑玉等的研究表明，当污水中粪大肠菌群大于2.4×104m L-1时，沙门菌的阳性检出率为84.3%，当粪大肠杆菌数量降为2.3～2.4×104m L-1时，沙门氏菌检出率骤降至12.5%［21］，和本研究结果较为接近。而段卫平等根据天津市污染水体中大肠菌群数与沙门菌的关系研究结果推测，当粪大肠菌群达到2.4×104m L-1时，沙门氏菌检出率≥76.9%［22］，其估计值与本研究有较大的出入，其原因可能是天津与温州的城市水体类型及污染成因不同，而且所使用方法的灵敏度存在差异。本研究结果显示，在指示微生物含量低于104mL-1的水体中，伤寒沙门氏菌没有检出；而在有机污染严重的水体中，指示微生物的含量迅速增加，伤寒沙门氏菌相应也具有较高的阳性检出率；Savichtcheva O等的研究也证实了该结论［23］，这表明指示微生物在一定程度上可以反映水体中病原微生物的存在情况。指示微生物的监测结果可以作为病原微生物污染状况的一个初步表征，进而为环境水体中疾病的风险评价提供一定的依据。

4 小结

本研究运用快速的LAMP方法与传统方法相结合，检测和分析了不同季节温瑞塘河环境水体中的粪大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和大肠埃希氏菌，证明了这些方法的有效性和实用性，为温瑞塘河微生物指标的检测提供了基础数据，也为环境水体中病原微生物和指示微生物的研究分析提供了理论和实践依据。

各个监测点的粪大肠杆菌的检出浓度大致为103～107m L-1，大肠埃希氏菌也大量存在于各个监测点水体中，统计学结果表明，粪大肠杆菌与大肠埃希菌这2种指示微生物之间存在显著相关性 （0.904）。伤寒沙门氏菌在水质良好的三垟湿地和密集生活区内的水体中阳性检出率差异显著，较常出现在污染严重的水体中，且当粪大肠杆菌的浓度为106m L-1以上时，伤寒沙门氏菌的阳性检出率为100%。

粪大肠杆菌的数量在一定程度上能指示伤寒沙门氏菌的存在情况，这种关联性说明在温瑞塘河水环境中常用指示菌能够用来表征病原菌的风险，但还需要更多的工作来明确不同环境条件下这种关联是否存在差异。环境水体中沙门氏菌的污染是公共卫生领域的极大隐患，所以应对沙门氏菌等水体病原菌进行长期的监测，探究其来源和影响因素，以减少人们感染相关疾病的风险。

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（责任编辑：侯春晓）

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A

0528-9017（2015）04-0448-05

10.16178/j.issn.0528-9017.20150402

2014-12-11

浙江省自然科学基金项目 （Y5110069）；温州市科技计划重点项目 （H20100052）；浙江省大学生科技创新活动计划（2012R413025）；温州市科技计划项目 （S20100036）

陈胜蓝。E-mail：454077194@qq.com。

商 栩。E-mail：copepod@sina.com。

文献著录格式：陈胜蓝，尹红果，陈梦清，等.环境水体中病原微生物与指示微生物的相关性研究 ［J］.浙江农业科学，2015，56（4）：448-452，537.