马钱子碱透皮贴剂镇痛实验研究及对大鼠脑啡肽含量的影响

崔 姣，许惠琴*，陶玉菡

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙410005；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京210046）

马钱子为马钱科植物马钱子(Strychnos nuxvomica L.)的干燥成熟种子，具有通络止痛、散结消肿的功效。 近年来， 马钱子广泛应用于各种肿瘤的临床治疗， 具有较好的抗癌和癌性疼痛的作用， 成为抗肿瘤中药研究的一个热点。 马钱子主要活性成分是吲哚类生物碱， 士的宁和马钱子碱是最主要的两种生物碱， 二者含量占马钱子总生物碱的70%～80%，其中马钱子碱是马钱子镇痛的主要活性成分[1]。 但是马钱子毒性较大，其治疗剂量和中毒剂量接近。

本实验室前期试验已经表明马钱子碱经皮给药后的绝对生物利用度为32.8%， 平均滞留时间（MRT）是静脉注射的8 倍，经皮给药途径可能有利于马钱子碱的减毒增效[2]，且初步进行了小鼠醋酸扭体实验的研究[3]。 本试验在此基础上研究马钱子碱透皮吸收后的镇痛作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 CL 级ICR 小鼠50 只， 许可证号：SCXK （苏）2008-0010；SD 大鼠100 只， 许可证号：SCXK(苏)2007-0001，由扬州大学比较医学中心提供。

1.1.2 主要药物 马钱子碱，日本和光纯药工业株式会社，批号：059-17；芬太尼透皮贴剂（西安杨森制药有限公司）。

1.1.3 主要试剂 冰醋酸： 上海化学试剂有限公司，批号：03081014。 5-HT，由Sigma 公司提供，批号：29H7011。磷酸盐缓冲液(PBS)：中杉金桥。氯化钠注射液，山东华鲁制药有限公司，批号：B08110807。氢氧化钠(NaOH)， 天津金汇太亚化学试剂有限公司，批号：20090420。

1.1.4 主要仪器 UniCel DxI800（BECKMAN COULTER）；5415R 低温高速离心机 （基因有限公司）；YLS-9A 生理药理电子刺激仪 （淮北正华生物仪器设备有限公司）；YLS 压痛仪（济南益延科技发展有限公司）；TB-04 型实验用精密涂布机（上海锴凯科技贸易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 马钱子碱透皮贴剂的制备 首先采用冷冻干燥法制备马钱子碱羟丙基-β-环糊精包合物，再在骨架材料溶液中加入马钱子碱包合物，采用精密涂布机涂布在背衬膜上，切割成型。1 cm2透皮贴剂含24 mg 马钱子碱， 分别切割成大约0.05、0.1、0.2 cm2用于小鼠药效学实验， 切割成大约0.25、0.5、1 cm2用于大鼠药效学实验。

1.2.2 测定马钱子碱透皮贴剂对电刺激致痛小鼠痛阈值的影响 取健康ICR 小鼠50 只，雌雄各半，体质量18～22 g，随机均分为5 组：（1）空白对照组（下称A 组）：空白基质；（2）芬太尼组（下称B 组）：40 mg/kg；（3）马钱子碱透皮贴剂小剂量组（下称C组）：60 mg/kg；（4）马钱子碱透皮贴剂中剂量组（下称D 组）：120 mg/kg；（5）马钱子碱透皮贴剂大剂量组（下称E 组）：240 mg/kg。 各组小鼠腹部剃毛器剃毛后，给予药物，用胶带固定。 每只小鼠给药1 次。

实验用生理实验多用仪进行，给药前将小鼠放在导电铜丝板上，通电后，调节电压输出钮，使电压由低到高，以秒表记录时间，当小鼠出现第一声尖叫时立即断电， 此段时间为小鼠用药前的痛阈值，固定此电压值不变，给药后在不同时间点（20 min及1、2、4、8、10 h） 以同等电压强度进行自身对照，刺激时间1 s，频率为8 Hz，电压保持不变。 用药前痛阈值低于15 s 者剔除不用， 用药后痛阈值超过45 s 即可切断刺激，痛阈以45 s 计。

1.2.3 测定马钱子碱透皮贴剂对大鼠5-HT 致痛作用的影响 取健康SD 大鼠50 只， 雄性， 体质量180～200 g， 随机均分为5 组：（1）A 组： 空白基质；（2）B 组： 20 mg/kg；（3）C 组：30 mg/kg；（4）D 组：60 mg/kg；（5）E 组：120 mg/kg。 各组大鼠腹部剃毛，给予药物后，用胶带固定。 每只大鼠给药1 次。

各组给药前用压足法测定大鼠右后足基础痛阈值(取3 次平均值，法码值小于50 g 或大于750 g弃之不用)。给药30 min 后，每只大鼠右后肢足跖皮下注射1%～2% 5-HT 0.1 mL 致炎，测量大鼠给药后1、2、4、8 h 致炎足的痛阈。

镇痛率=[(给药后痛阈值-给药前痛阈值)／给药前痛阈值]×100%

1.2.4 测定马钱子碱透皮贴剂对大鼠大脑功能区脑啡肽含量的影响 取健康SD 大鼠50 只，雌雄各半，体质量180～200 g，分组及给药方法同“1.2.3”。每只大鼠给药1 次。

大鼠禁食过夜，次晨给药后30 min，在安静状态下快速断头取脑，置煮沸生理盐水中3 min。取出后依照图谱取脑干、下丘脑、丘脑与纹状体。 各脑区分别称质量后置3 mL 的1.0 mol/L 盐酸匀浆器中制成匀浆， 再加0.3 mL 的1.0 mol/L NaOH 及0.7 mL 的0.5 mol/L pH 7.6 的磷酸缓冲液，最后加PBS 液，补足至5 mL 后离心20 min，取上清液在放免测定仪上作放射免疫分析（RIA）测定，依照标准曲线将实验结果换算成每克脑组织中的脑啡肽含量(pg)。

1.3 统计学分析

所有数据使用SPSS 16.0 软件进行处理。 实验数据用“±s”表示，组间差异显著性判断采用方差分析，组间比较采用LSD 检验。

2 结果

2.1 马钱子碱透皮贴剂对电刺激致痛小鼠痛阈值的影响

实验结果显示：马钱子碱透皮贴剂3个剂量组在4、8、10 h 3个时间点能提高小鼠痛阈值百分率，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。 见表1。

2.2 马钱子碱透皮贴剂对5-HT 致炎后大鼠足压痛的影响

实验结果显示：E 组在1、2、4、8 h 4个时间点能提高致炎大鼠足压痛的痛阈值百分率，与A 组比较差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；D 组在2、4、8 h 3个时间点能提高致炎大鼠足压痛的痛阈值百分率， 与A 组比较差异有统计学意义 （P＜0.01，P＜0.05）。 C 组在2、4 h 2个时间点能提高致炎大鼠足压痛的痛阈值百分率，与A 组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。 见表2。

表1 马钱子碱透皮贴剂对电刺激致痛小鼠痛阈值的影响 （±s，n=10，s）

表1 马钱子碱透皮贴剂对电刺激致痛小鼠痛阈值的影响 （±s，n=10，s）

注：与A 组比较*P＜0.05，**P＜0.01。 下表同。

组别A 组B 组C 组D 组E 组剂量（mg/kg）—40 60 120 240 20 min 11.6±7.4 12.9±12.3 11.2±4.5 13.1±6.1 16.5±14.3 1 h 12.4±8.7 24.6±17.2 14.9±6.4 13.8±5.3 24.1±16.0 2 h 12.7±10.5 27.7±17.2*23.5±11.2 21.5±8.9 26.6±16.8 4 h 10.6±8.8 29.1±16.9*25.1±14.0*30.4±11.9**37.8±13.9**8 h 13.3±8.9 33.8±14.3**27.7±14.4*31.4±12.5**33.5±16.3**10 h 18.2±8.9 33.1±16.2*29.9±11.3*29.8±13.9*36.9±13.4**测量时间点

表2 马钱子碱透皮贴剂对5-HT 致炎后大鼠足压痛的影响（镇痛率） （±s，n=10，%）

表2 马钱子碱透皮贴剂对5-HT 致炎后大鼠足压痛的影响（镇痛率） （±s，n=10，%）

组 别A 组B 组C 组D 组E 组剂量（mg/kg）—20 30 60 120 1 h 15.7±68 46.3±39 66.6±63 185.2±156 172.4±135*2 h 21.1±51 87.7±81*181.0±137**200.0±181**271.7±190**4 h 32.9±51 178.5±109**170.1±117**200.2±191**236.8±175**8 h 24.1±59 97.5±95*86.5±63 146.2±127*135.6±110*测量时间点

2.3 马钱子碱透皮贴剂对大鼠功能区脑啡肽含量的影响

实验结果显示：D 组、E 组能提高大鼠大脑功能区脑啡肽的含量，与A 组比较差异有显著统计学意义（P＜0.01），见表3。

表3 马钱子碱透皮贴剂对各组大鼠功能区脑啡肽含量的影响 （±s，n=10）

表3 马钱子碱透皮贴剂对各组大鼠功能区脑啡肽含量的影响 （±s，n=10）

组别A 组B 组C 组D 组E 组剂量（mg/kg）—20 30 60 120脑啡肽含量（pg/g）9.85±3.27 12.27±3.04 12.62±4.47 15.37±3.57**16.49±1.99**

3 讨论

经皮途径给药可能是避免马钱子碱毒性反应的有效手段。 马钱子碱同时具有中枢和外周镇痛作用[1]，经皮给药途径降低中枢神经毒性的同时可能降低了其中枢镇痛作用，但对外周镇痛作用（如麻痹神经末梢）影响可能不大。 前期实验通过小鼠醋酸扭体法表明马钱子碱贴剂透皮吸收完全，能对抗醋酸引起的小鼠扭体反应[3]。 本实验结果表明马钱子碱透皮贴剂能提高小鼠电刺激致痛的痛阈值和5-HT 致炎大鼠的镇痛率。 与芬太尼组比较，马钱子碱组能发挥与其等同的药效。

脑啡肽是神经内分泌系统产生的一种多肽激素，属内源性阿片样物质。 内源性阿片肽是体内具有阿片样活性的一类物质，通过作用于不同部位的各种类型的阿片受体，发挥复杂而又多样的生理调节作用。 大脑功能区的脑啡肽是脑内含量最高的内源性神经肽，具有广泛的镇痛作用[4]。 芬太尼为阿片受体激动剂，属强效麻醉性镇痛药，治疗中度到重度慢性疼痛以及那些只能依靠阿片样镇痛药治疗的难消除的疼痛， 但是芬太尼血清的浓度逐渐增加，在12～24 h 内达到稳定，故在给药30 min 后对脑啡肽的影响不大。 马钱子中、大剂量组能提高大鼠大脑功能区脑啡肽的含量，提示马钱子碱的中枢镇痛作用可能是通过增加脑内神经递质--脑啡肽发挥镇痛作用，并且血清的浓度增加较快。

综上， 马钱子碱透皮贴剂具有较好的镇痛作用，吸收比较快，作用时间比较长，减少给药的频率，避免了药物浓度的波动，能起到平稳镇痛，极大程度上避免了马钱子的毒性作用。 此外，马钱子碱透皮贴剂镇痛作用可能是通过增加大脑功能区脑啡肽的含量，作用于阿片受体，起到中枢镇痛的作用。

[1]Yin W，Wang TS，Yin F Z，et al. Analgesic and anti-inflammatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted from seeds of Strychnosnux-vomica [J]. J Ethnopharmacol，2003，88(2-3)：205-214.

[2]陈 军，王立杰，蔡宝昌，等.马钱子碱经皮给药后在小鼠体内的药动学研究[J].中草药，2010，41(8)：1 350-1 352.

[3]胡 巍，陈 军，蔡宝昌，等.马钱子碱经皮给药的镇痛作用[J].中华中医药学刊，2008，26(2)：385-386.

[4]Braz J，Beaufour C，Coutaux A，et al. Therapeutic efficacy in experimental polyarthritis of viral-driven enkephalin overproduction in sensory neurons [J]. J Neurosci，2001，21(20)：7 881-7 888.