MCM2与Cx43蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的表达和临床意义

卿 蕊，范自力*，黄泽智，姜艳红，肖 盛，杨 秦

（1.中南大学湘雅三医院血液科，湖南 长沙410013；2.中南大学湘雅三医院病理科，湖南 长沙410013；3.邵阳医学高等专科学校检验系，湖南 邵阳422000）

非霍奇金淋巴瘤 （non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）是一组起源于血液淋巴系统的恶性肿瘤。因其临床表现多样、病理类型复杂、异质性明显，严重危害人类健康而成为当前肿瘤研究的一个热点。 微小染色体维持蛋白2（Minichromosome maintenance proteins 2，MCM2）是一种重要的DNA 复制启动子[1]。 在DNA 复制的起始和延伸过程中起着重要作用。 细胞间隙连接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是一种存在于细胞之间的通道蛋白，它负责细胞之间物质及信息的交换，对肿瘤的发生发展起着抑制调控作用[2]。 Ki-67是一种核蛋白抗原，是目前公认能反映细胞增殖活性的指标，可用于判断淋巴瘤恶性程度及预后[3]。 本研究采用免疫组织化学方法（SP 法）检测60 例NHL组织中MCM2、Cx43 蛋白的表达情况， 并分析其表达与临床病理特征的关系，进一步探讨它们与NHL发生发展机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2013年10月至2014年10月在中南大学湘雅三医院手术切除并经病理证实为非霍奇金淋巴瘤患者组织标本60 例及反应性增生淋巴结患者（reactive hyperplasia of lymph node，RH）组织标本20 例。 所有标本均由本院两位病理科高年资医生行蜡块切片复查， 所选标本病例诊断明确符合WHO[4]标准。 60 例NHL 患者中，男34 例，女26 例；年龄12～86 岁，中位年龄52.6 岁；惰性NHL（低度恶性）14 例，包括滤泡性淋巴瘤2 例、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤6 例、小淋巴细胞性淋巴瘤4 例、淋巴浆细胞淋巴瘤2 例；侵袭性NHL（中高度恶性）46 例，包括弥漫大B 细胞性淋巴瘤36 例、 渐变性大B 细胞性淋巴瘤2 例、 血管免疫母T 细胞淋巴瘤2 例、NK/T 细胞淋巴瘤2 例、外周T 细胞淋巴瘤4 例。 所有患者均为初治患者，均通过手术或影像检查确定肿瘤侵犯部位。 采用Ann Arbor 分期系统[5]分期，按国际工作分型，经形态及免疫组化反应区分T、B 细胞亚型，按全身症状分组。

1.2 试剂与仪器

兔抗人MCM2 多克隆抗体（10513-1-AP）、兔抗人Cx43 多克隆抗体（15386-1-AP），稀释倍数均为1∶50，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。二抗为快捷型酶标羊抗兔IgG 聚合物，DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司， 二甲苯、乙醇、3%H2O2、 枸橼酸钠等常规试剂购自北京化学试剂公司。 YD-315 切片机（浙江金华益迪试验器材），BA2T 显微镜（Motic），BMJ-A 包埋机（常州中威电子仪器）。

1.3 实验方法

蜡块包埋标本连续切片4 μm， 防脱捞片，60 ℃烤片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，微波炉抗原修复，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，加一抗4 ℃过夜孵育，PBS 液洗5 min×3 次，加二抗37 ℃孵育30 min，PBS 液洗5 min×3 次，DAB显色1～5 min，蒸馏水冲洗终止显色，苏木素复染胞核，盐酸酒精分化，流动自来水返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。以PBS液替代一抗作阴性对照，以正常淋巴结组织的阳性切片作阳性对照。

1.4 结果判定

MCM2 的阳性染色部位为细胞核，Cx43 的阳性染色部位为细胞膜、细胞质。 在染色均匀的区域，选取5个(上、下、左、右、中)高倍镜视野（×400）：（1）按阳性细胞百分率（A 值）评分：1%～25%为1 分，25%～50%为2 分，＞50%为3 分；（2）按染色强度（B 值）评分：不着色为0 分，浅棕黄色为1 分，棕黄色为2分，棕褐色为3 分。 综合A+B 值判断结果。 阴性（-）为0 分，弱阳性（+）为1～2 分，中度阳性（++）为3～4分，强阳性（+++）为5～6 分。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0 版软件进行处理。 组间率的比较用χ2检验计数资料分析， 相关性分析用Pearson等级相关分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NHL 和RH 组织中MCM2、Cx43 蛋白的表达

MCM2 为胞核表达，Cx43 为胞膜、胞质表达。 阳性染色均是棕黄（褐）色颗粒或团块。 MCM2 在NHL中阳性表达率为86.67%（52/60）明显高于在RH 组织中的25.00%（5/20），Cx43 在NHL 组织中的阳性表达率是20.00%(12/60) 明显低于在RH 组织中的60.00%（12/20）， 比较差异均有统计学意义 （P＜0.01）。 见表1。

2.2 MCM2、Cx43 蛋白在NHL 中的表达与临床病理特征的关系

NHL 中MCM2 的表达与恶性程度、 临床分期、Ki-67 水平有关（P＜0.01 或P＜0.05），而与性别、年龄、全身症状、免疫分型无关（P＞0.05）；NHL 中Cx43 的表达与恶性程度有关（P＜0.01），而与性别、年龄、全身症状、免疫分型、临床分期、Ki-67 水平无关（P＞0.05）。 见表2、封三彩图1～2。 表明MCM2 的过度表达、Cx43 的低水平表达均与NHL 的恶性程度密切相关。

表1 MCM2、Cx-43 蛋白在NHL 和RH 组织中的表达 （例）

表2 MCM2、Cx43 蛋白表达与NHL 患者临床病理特征的相互关系 （例）

60 例NHL 中MCM2、Cx43 蛋白的表达相关性无统计学意义（r=-0.05，P=0.80）。 可能由于本研究观察样本较少，观察周期短等因素所致。

3 讨论

肿瘤发生发展的核心环节是细胞异常增殖，而细胞增殖决定于细胞周期， 细胞周期受DNA 复制的调控， 所以检测DNA 复制起始相关蛋白可预测肿瘤的发生。 MCM 家族就是DNA 复制起始调控蛋白之一。MCM2 是其家族的一员，它是近年来发现的一种能较好地反映细胞增殖活性程度的指标。 它在细胞处于分化成熟或静止期含量较少， 而在增殖、转化的细胞中，MCM2 含量从G0 期开始增加，到G1 末期和S 早期达到高峰，并与染色质结合，在S期至M 期成为游离的MCMC2，G2 期与M 期降低。由于这种与细胞增殖过程相一致的周期性变化，目前已将它视为S 细胞的标记物[6]，被认为是特异性增殖相关因子癌前标记[7]，是研究细胞能动性及评估肿瘤预后的较好指标。大量文献报道，MCM2 在各种肿瘤细胞中高表达。 Mukherjce 等[8]采用免疫组化研究发现MCM2 阳性表达率与病理结果完全一致。Koto 等[9]研究表明MCM2 在食管鳞癌中的表达与淋巴转移、病理分期、组织学分级等有关。 本研究发现，MCM2 在NHL 组织中阳性率表达显著高达86.67%，而在RH 组织中阳性率仅为25%，且MCM2在NHL 中的阳性率随着恶性程度、临床分期及Ki-67 水平升高而升高， 说明MCM2 在癌细胞中的DNA 复制起点较多， 提示MCM2 高表达与NHL 发生密切相关。

细胞间隙连接通讯 （gap junction intercellular communication，GJIC） 是细胞间的重要连接方式，其基本结构单位是Cx，人类编码Cx 基因有21 种，其中Cx43 是最广泛最充足表达的间隙蛋白[10]，它在间隙连接介导的GJIC 方面发挥着重要作用。 近年来研究发现，Cx43 表达异常和GJIC 功能缺陷与多种肿瘤的恶性增殖和转化密切相关， 表现为表达水平下调[11]。例如胶质瘤[12]、肺癌[13]、乳腺癌[14]、前列 腺癌[15]等普遍存在Cx43 的表达降低或缺失，但目前少见其与NHL关系的文献报道。 本研究Cx43 在NHL 中的表达水平较RH 中的明显降低，说明Cx43 的低表达与NHL癌变密切相关，可视为癌前病变的早期事件。

本研究发现二者无明显相关，可能由于本研究观察样本较少，观察周期短等因素，结果有待后续研究证实。 但前者为高表达而后者为低表达是明确的， 且MCM2 的过度表达与Cx43 的低水平表达与NHL 的恶性程度密切相关。

综上所述，MCM2 蛋白在细胞增殖过程中起着关键作用，检测NHL 组织中的MCM2 蛋白表达，能反映NHL 的恶性程度， 具有潜在的临床应用价值；而Cx43 作为一种肿瘤抑制因子， 临床检测能作为NHL 预防的参考指标。 作为细胞周期重要的调控蛋白，MCM2 和Cx43 的联合检测，将有助于NHL 的早期诊断及预后的参考。 随着后续研究的深入，MCM2有望成为NHL 治疗上的新靶点。

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