不同产地人工栽培黄花石蒜不同器官中加兰他敏含量测定

刘湘丹，王 姣，李凤娟，周日宝*，王朝晖，刘笑蓉

（湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208）

黄花石蒜（Lycoris aurea Herb.），又名忽地笑，为石蒜科（Amaryllidaceae）石蒜属（Lycoris）的草本植物[1]。 其含有多种生物碱，如石蒜碱、加兰他敏、力可拉碱等，其中加兰他敏（Galanthamine）是一种可逆性胆碱酯酶抑制剂，易透过血脑屏障，产生较强的中枢作用，可用于重症肌无力、进行性肌营养不良、脊髓灰质炎后遗症及老年痴呆症的治疗，是目前临床上治疗老年痴呆症的首选药[2-4]。

黄花石蒜鳞茎因含有较高的生物碱，是目前提取加兰他敏等生物碱的主要原料，药厂长期大量采挖野生黄花石蒜鳞茎，致野生资源濒临枯竭；同时，产地山丘也被挖得千疮百孔，造成水土流失，环境破坏严重。

本文充分利用人工栽培黄花石蒜的资源，寻找高含量的药材原料，探索黄花石蒜中加兰他敏的最佳采收部位及最适种植区。 现将方法与结果报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 LC 高效液相色谱仪 （含二元泵、柱温箱、手动进样器、紫外检测器）（安捷伦科技有限公司）；JY3002 电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）。

1.2 材料

黄花石蒜植物全株分别于2013年7月采自湖南省南岳衡山、浏阳市大围山、湖南中医药大学药植园的人工栽培黄花石蒜基地。 将黄花石蒜花、花葶、鳞茎和根分别于60 ℃烘箱内烘干，粉碎，过60目筛，备用。

1.3 试剂

加兰他敏对照品(南京泽朗医药科技开发有限公司，纯度为99%)；95%乙醇、氨水、盐酸、甲醇、磷酸、三氯甲烷均为分析纯；重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取加兰他敏对照品5.0 mg 和7.0 mg，分别置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解，并定容，即得0.500 mg/mL 和0.700 mg/mL的加兰他敏对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备[5-6]取黄花石蒜花和根(花葶和鳞茎)粉末各约1.0 g（各约5.0 g)，精密称定，加95%乙醇50 mL，水浴加热回流1 h，提取2 次， 过滤， 合并滤液， 水浴挥干， 残渣加0.1 mol/L 盐酸25 mL 溶解，过滤，滤液加氨水调至pH 9.0， 以三氯甲烷萃取3 次， 每次25 mL，合并萃取液，水浴挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10 mL，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取滤液，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相0.1%磷酸-甲醇(92∶8)；流速1.0 mL/min；检测波长238 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃。 在本色谱条件下，各供试品溶液中加兰他敏可与相邻峰分离良好，峰形对称，保留时间均约为12.0 min。 对照品、衡山黄花石蒜花、根、花葶、鳞茎样品HPLC 图见图1。

图1 加兰他敏对照品溶液和衡山黄花石蒜各部位供试品溶液的HPLC 图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围考察 分别精密量取对照品溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL， 用甲醇定容至5 mL 量瓶中(加兰他敏浓度分别为25、50、75、100、125、150 μg/mL)， 用0.45 μm 微孔滤膜过滤后，分别精密量取10 μL 注入液相色谱仪， 记录峰面积，以峰面积为纵坐标、进样浓度为横坐标，得线性回归方程为：Y=3.371X-8.99(r=0.999 9)表明加兰他敏对照品溶液的浓度在25～150 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 精密量取75.0 μg/mL 对照品溶液10 μL，连续进样6 次，测定，得加兰他敏峰面积的RSD 为0.7%（n=6），表明实验仪器的精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 分别精密量取同一供试品溶液10 μL 于2、4、6、8、12、24 h 进样，测定，得加兰他敏峰面积的RSD 为1.9%（n=6），表明供试溶液中加兰他敏在24 h 内稳定。

2.3.4 重复性试验 分别取南岳衡山黄花石蒜花和鳞茎粉末各约1.0 g 和5.0 g，精密称定，各平行6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取10 μL 进样，测定，计算花(鳞茎)中加兰他敏的平均含量为0.135%(0.0204%)， 其RSD 值为1.7%(1.9%)（n=6），表明本方法的重复性好。

2.3.5 回收率试验 取已知加兰他敏含量的南岳衡山黄花石蒜(鳞茎) 粉末约0.5 g（约2.5 g），精密称定， 各平行6 份， 花和鳞茎样品分别加入0.700 mg/mL 和0.500 mg/mL 的加兰他敏对照品溶液1 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并分别进行测定，记录峰面积，结果见表1。

表1 黄花石蒜花的加样回收率测定结果

2.4 样品含量测定结果

分别取黄花石蒜各组样品， 各平行2 份，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液。 分别精密量取10 μL 进样，测定。 计算加兰他敏的平均含量，结果见表2。

表2 不同产地人工栽培黄花石蒜各器官中加兰他敏含量比较 （%）

2.5 统计学分析结果

将黄花石蒜不同器官、不同产地和加兰他敏含量三个变量用SPSS 17.0 软件进行方差分析， 分析结果见表3，所选Corrected Model（模型检验）具有显著统计意义(P=0.000＜0.001)，黄花石蒜不同器官加兰他敏的含量差别也具有显著统计学意义(P=0.000＜0.001)，其含量由高到低依次为：花＞根＞花葶＞鳞茎；不同产地黄花石蒜中加兰他敏含量差别无统计学意义（P＞0.05）。

表3 不同器官、不同产地与加兰他敏含量方差分析结果

3 讨论

3.1 黄花石蒜不同器官中加兰他敏含量比较

从表3 中数据统计分析结果可以看出，器官栏中P=0.000＜0.001，说明人工栽培黄花石蒜各器官中加兰他敏含量存在非常显著的统计学差异。 从表2可知，不同器官中加兰他敏含量差别大，花中含量最高，而鳞茎中最低，前者约为后者的8 倍。 而在不同产地的同一器官中加兰他敏含量差别很小，花中差别最小(RSD=2.4%，n=3)，鳞茎中差别最大(RSD=18%，n=3)。 各器官加兰他敏含量高低依次为： 花＞根＞花葶＞鳞茎，提示黄花石蒜中加兰他敏含量主要集中在花中， 且其含量远远高于其传统入药部位地下鳞茎中含量。

传统方法往往靠采挖野生黄花石蒜地下鳞茎提取加兰他敏的原料，仅具一次性收益，生产成本高，采挖野生黄花石蒜鳞茎的劳动强度大，且劳务费用成本高。 如以人工栽培黄花石蒜的花作为提取加兰他敏的药材原料，其可连续多年采收，投入少，长期性收益，劳动强度小，生产成本及劳务费用成本低。 结合黄花石蒜鳞茎和花中加兰他敏的平均含量及采收特点进行综合比较分析得出，以采收黄花石蒜花作为加兰他敏的药材原料具有更广阔前景。

3.2 人工栽培黄花石蒜不同产地中加兰他敏含量比较

从表3 中数据统计分析结果可以看出，不同产地样本中加兰他敏含量差异无统计学意义 （P＞0.05），说明三个产地人工栽培黄花石蒜各相同器官中加兰他敏含量差异无统计学意义。

[1]中国科学院植物志编委.中国植物志（第16 卷）[M].北京科学出版社，1985：20.

[2]王晓燕，黄敏仁，韩正敏，等.石蒜属植物忽地笑中化学成分的GC-MS 分析[J].中草药，2007，38(2)：188-217.

[3]朱 奇，李振涛，纪 宇.加兰他敏治疗阿尔茨海默病作用机制的研究进展[J].天津药学，2005，17(3)：38-40.

[4]洪 霞，张振馨，王鲁宁，加兰他敏治疗轻中度阿尔茨海默病的随机双盲对照研究[J].中华神经科杂志，2006，39(6)：379-382.

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