Fmoc固相合成生长激素释放肽-2

王小青，郑 霄，尹志峰，王良友（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

Fmoc固相合成生长激素释放肽-2

王小青，郑 霄，尹志峰，王良友
（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

GHRP-2；Fmoc固相合成；纯化

生长激素释放肽（GHRP）于20世纪70年代末、80年代初依据蛋氨酸-亮氨酸脑啡肽的结构首次合成［1］，之后又合成了数种类型的GHRP［2］。研究发现，结构改造后的GHRP-2（又名KP-102，药品名为Pralmorelin，氨基酸序列为D-Ala-（D-β-naphthyl）-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2）具有更强的刺激生长激素释放和改善儿童生长激素缺乏症的作用［3-4］。2004年，Pralmorelin用于治疗身材矮小症的Ⅱ期临床试验已在日本开始进行［5］。GHRP造价低廉，给药简便，在下丘脑生长激素释放激素无效时仍可产生作用，不影响或少影响生长素的内源节律性释放，具有明显的药物发展前景［2，5］。

20世纪90年代末，王勤等［6-8］采用Merrifild固相法合成了生长激素释放肽并对其活性进行了测定。但现有的制备方法操作难度大，不利于工业生产，而我们也未检严守纪律到国内以Fmoc固相合成方法合成生长激素释放肽的文献。本研究以GHRP-2为研究对象，采用Fmoc固相合成策略，优化合成工艺，合成了含有3个D型氨基酸的GHRP-2，以期为工业化量产提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 戴安U3000高效液相色谱仪（UV检测器，美国戴安公司），Newstyle型反相高效半制备液相色谱仪（苏州汉邦科技有限公司），戴安液相色谱质谱联用仪Ultimate 3000/ MSQ（美国戴安公司），CHRIST冻干机（北京博励行仪器有限公司），高速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试剂 固相合成载体Rink-Amide-AM树脂（天津南开合成科技有限公司，替代度为0.58mmol/g），肽链中所有保护氨基酸（成都诚诺新技术有限公司），HOBt、DIC（苏州中科天马肽工程中心有限公司），冰乙醚、TFA（天津市风船化学试剂科技有限公司），哌啶、苯甲硫醚、间甲酚与苯甲醚（上海晶纯试剂有限公司），EDT（Sigma-Aldrich），DMF（天津市科密欧化学试剂有限公司），DCM（天津博迪化工股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 Fmoc-Lys（Boc）-Rink Amide-AM树脂的制备 在洗净并干燥的反应柱中，加入896.2mg（0.5mmol）Rink Amide-AM树脂，加DMF通氮气溶胀30min，充分溶胀后抽掉DMF，加入适量DBLK溶液（哌啶/DMF（V/V）=1：4）脱Fmoc保护基两次，时间分别为5min和7min，茚三酮检测合格后，用DMF和DCM分别洗涤树脂，抽干溶剂。称942.0mg（2 mmol）Fmoc-L-Lys（Boc）-OH 和27.1mg HOBt（2mmol）溶于DMF，冰浴并加入310μl（2mmol）DIC活化5min，加入反应柱反应，茚三酮检测合格后，抽干，分别用DMF与DCM洗涤树脂，并进行替代度检测，加入11ml的醋酸酐与吡啶（V/V，6：5）混合液封闭14小时。冲洗树脂，加甲醇收缩两次（5min/次），减压干燥至恒重，得干燥树脂0.971g。

2.2 GHRP-2逐 步 偶 联 将2.1制 备 的Fmoc-Lys（Boc）-Rink Amide-AM树脂置于反应柱中，加入DMF溶胀30 min，按照附表进行氨基酸偶联，偶联结束后脱去最后一个氨基酸氨基并用甲醇收缩树脂，抽干并称重得GHRP-2肽树脂1.185g。

偶联D-Phe、D-βNal和D-Ala三个D型氨基酸时反应时间控制在120min以内，反应时间在100min时茚三酮检测合成效果最好，反应时间越长，粗肽HPLC检测杂质越多，得率也较低。GHRP-2序列中含有疏水性氨基酸Ala，Phe以及D-βNal等，在反应的过程中添加N-甲基-2吡咯烷酮（NMP）来增强疏水性氨基酸的溶解性，加快反应。见附表：

附表 固相Fmoc保护策略偶联反应的一般程序

2.3 肽树脂的裂解 平行称取干燥至恒重的GHRP-2-Rink Amide-AM树脂200.0mg 3 份，置于玻璃烧瓶中，分别加入裂解液①TFA：间甲酚（99：1）、②TFA：苯甲硫醚：EDT：苯 甲 醚（9：0.5：0.3：0.2）、③TFA：EDT：间 甲 酚（9.5：0.4：0.1）各2ml，冰浴反应30min，逐渐升至室温，于室温下反应1h。过滤，用少许TFA洗涤树脂，将滤液倾入40ml无水冰乙醚中，析出白色固体，0℃静置沉降20min。4000 r/min离心4min，弃去上清液，重复5次，真空干燥至恒重，得白色固体。

2.4 粗肽的纯化与鉴定 粗肽无氧水溶解，加少量醋酸助溶，置于4℃冰箱放置过夜。半制备液相条件：半制备柱Hedera ODS-2反相硅胶柱（20×250mm，10μm）；检测波长215nm；采用乙腈/0.1%TFA水分离体系，流速8ml/min，乙腈25%-55%，洗脱时间30min。纯化后样品经戴安U3000高效液相分析，反相柱Kromasil C18（4.6×250mm，5μm），以乙腈/水为分析体系（0.1%TFA），乙腈5%-95%，流速1ml/ min，20min梯度洗脱，检验洗脱液纯度。粗肽纯度为80%，经半制备液相纯化得GHRP-2纯度大于99.0%。结构经ESIMS分析确证，质谱图显示［M+H］+峰m/z 818.6，［M+H］2+ 峰m/z 410.0，质谱数据与理论值相符。

3 讨论

GHRP-2含有D-氨基酸和β-氨基酸，产物结构与活性密切相关，环境对产物影响较大，易发生消旋、氧化等副反应，产率也较其它多肽产品低。本研究选择消旋率小的缩合体系，控制反应时间和反应温度，优化裂解条件和纯化手段得到纯度大于99.0%的目标产物。

固相合成中固相载体的选择非常关键，不仅关系到合成速率，对合成目标肽的纯度、收率都有重要的影响。本研究选用的Rink Amide-AM树脂主要用来合成末端羧基氨基化的多肽［9-10］，同时，在实验过程中对不同替代度的树脂进行了比较，发现树脂替代度在0.4-0.45mmol/g时产物的得率和纯度最好。根据氨基酸种类选择三种裂解液配比与裂解方法进行了平行比较，结果粗肽得率无统计学差异。因此，本研究选择成本最低的TFA：间甲酚=99：1进行裂解。温度、反应时间和裂解试剂剂量是实验中重要的影响条件。

采用F moc固相合成方法合成GHRP-2，该方法简单，目标产物得率与纯度较高，能够为工业化量产提供理论依据。

［1］Bowers CY， Momany F， Reynolds GA， et al. Structure-Activity Relationships of a Synthetic Pentapeptide that Specifically Releases Growth Hormone in Vitro［J］. Journal of Endocrinological Investigation， 1980，106（3）：663-670.

［2］陈晨.生长素释放肽的发现、发展及展望［J］.基础医学与临床，2002，22（1）：1-5.

［3］Wu D， Chen C， Katoh K， et al. The effect of GH-Releasing Peptide-2 （GHRP-2 or KP 102） on GH secretion from primary cultured ovine pituitary cells can be abolished by a specific GH-Releasing Factor （GRF） receptor antagonist［J］. Journal of Endocrinological Investigation， 1994， 140（2）：R9-13.

［4］Pralmorelin.改善儿童生长激素缺乏症［J］.国外医药-合成药生化药制剂分册，1999，20（2）：81-82.

［5］厉保秋.多肽药物研究与开发［M］.北京：人民卫生出版社，2011.185.

［6］王勤，高立伟，胡小愚，等.生长激素释放肽（GHRP）的合成及促生长效应［J］.兰州大学学报（自然科学版），1996，32（1）：98-101.

［7］嘉庆，高立伟.生长激素释放肽的合成及促生长作用研究［J］.西南工学院学报，2000，15（4）：26-29.

［8］胡晓愚，王勤.生长激素释放肽的合成及促生长活性［J］.生物化学与生物物理进展，1995，22（6）：549-552.

［9］王德心，冯鹤鹤，杨潇骁，等.活性多肽与药物开发［M］.北京：中国医药科技出版社，2008.489.

［10］郑彦慧，张艳平，张浩.Rink Amide树脂结构对多肽合成的影响研究［J］.离子交换与吸附，2008，24（6）：563-569.

（技术方法栏目编辑：张 健）

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2014-09-13）